典型工业酯酶的催化机制、理性设计及定量构效关系研究

(S)-(+)-2,2-dimethylcyclopropane carboxylic acid is a crucial chiral intermediate for the synthesis of a widely prescribed drug named cilastatin. In our previous work, a recombinant esterase REH is found to be capable of catalyzing the bioresolution of ethyl (+)-2,2-dimethylcyclopropane carboxylate. However, the wild type REH has a very low activity. It is crucial to investigate the catalytic mechanism of the enzyme so that one can engineer enzymes with improved catalytic efficiency through rational design. In this project, we will perform all-atom molecular dynamics (MD) simulation and quantum mechanics/molecular mechanics (QM/MM) analysis of the wild type and mutant REH enzymes, both apo and in complex with substrate, to investigate the binding and catalytic mechanisms of the substrate in different enzymes. Important mutations that affect the enzymatic activity will be identified through structural analysis as the “hot spots”, which will be followed by site-directed mutagenesis and saturated mutation experiments to search for enzymes with improved catalytic efficiency and/or suitability for industrial applications. Finally, leveraging various experimental and computational data collected in this study, Quantitative Structure-Activity Relationship (QSAR) models will be constructed for predicting the catalytic activities of the enzyme toward a wide variety of potential substrates. Our work will provide important molecular-level insights into the catalytic mechanisms of esterase REH, which will help guide future development of more efficient and versatile REH variants with improved substrate specificity.

课题组近期克隆表达出新的手性酯水解酶REH，它能催化手性拆分合成畅销药物西司他汀的关键中间体(S)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸。但是野生型酶的催化效率相对较低，因此探索酶的催化机理并理性改造具有重要研究意义。本项目运用生物信息学方法构建野生及突变型REH酶与底物复合物的三维结构，利用分子动力学模拟、混合量子力学和分子力学方法，分析酶与底物结合模式和结合自由能的变化，揭示酶的催化反应机理。在此基础上，对酶活性中心口袋的关键氨基酸进行突变结果预测，找出影响酶活性的热点氨基酸，结合定点饱和突变等实验手段，获得能提高酶催化活性的突变株。最后通过定量构效关系研究方法，对不同底物结构与酶催化活性的关系进行分析，从而构建底物催化活力的预测模型，可以进一步理性拓展酶的底物谱。针对水解酶REH进行催化机理研究、理性设计改造和结构-功能分析，将揭示酶活性的关键影响因子，并为实现酶的广泛应用提供理论依据。

课题组前期成功获得酯酶RhEst1，可以催化水解(S)-2,2-二甲基环丙烷甲酸乙酯，生成合成肾脱氢肽酶抑制剂西司他汀的关键手性中间体(S)-环丙甲酸。通过蛋白质工程手段，获得突变体A147I/V148F/G254A (M1)其比活力提高至野生型的4.6倍，但是其产物的光学纯度eep降至91%。后续通过对RhEst1帽子区域进行局部定向进化，获得突变体A143T/A147I/V148F/G254A (M2)，其比活力提高至野生型的6倍，解链温度较母本提高了11°C，对映体选择率提高至95。本项目首先通过分子动力学模拟、结合自由能计算等方法，解析了S-DmCpCe或R-DmCpCe底物在突变体中的结合模式差异，探究活力提高和选择性恢复的原因。M2中Ser101更利于亲核进攻底物羰基碳原子，形成四面体结构，底物处于更活跃的结合模式。A143位于α4螺旋上，突变后对“170-179”的构象变化有直接相关性。突变体M2中，143位苏氨酸与226位丝氨酸形成氢键相互作用，“170-179”环结构在模拟过程中稳定在“打开”的构象，有利于产物醇从活性口袋的释放。利用氨基酸相互作用网络来分析酶的结构稳定性。M1中, Phe148与Phe200 形成 π-π stacking。M2中, Phe148与Phe200, Phe166 和 Trp33形成 π-π stacking。由此看出Phe148的突变是热稳定性提高的关键氨基酸。针对选择性和热稳定性的机理研究，Thr143 增强了α4和“170-179” loop间的相关性，在选择性改造中起重要作用。而Phe148形成的 π-π stacking 相互作用稳定了酶的帽子结构，是热稳定性提高的关键氨基酸。基于催化机理的解析，综合考虑氨基酸的位置、动力学特征以及序列保守性，理性预测了能提高酶比活力的六个突变体。针对稳定性和选择性理性设计了在S226X 和A143X进行饱和突变，并且将Phe148突变成其他可能形成π-π stacking的氨基酸位点。通过实验验证，最终两个突变体G126S和R133L的催化活力比野生型有显著提高。我们构建了两种3D-QSAR模型来预测酶的比活力，同时研究了酶与底物的构效关系。用建立的模型预测了数据库ZINC15部分化合物的活力并进行实验验证，证明了3D-QSAR模型对新底物的预测能力，拓展了酶的底物谱。