卵母细胞区域特异性DNA甲基化擦除技术的研究

During the migration of primordial germ cell and oogenesis of mammals, female germ cells undergo globally erasure and establishment of DNA methylation. During this process, disease and environmental factors could not only disturb the erasure and establishment of DNA methylation, but also deliver the DNA methylation mutations from parents to the offspring. As the progress of assistant reproductive technology and the deep investigations of DNA active demethylation, it is practicable to region-specifically demethylate the methylcytosines of genome DNA. In the CRISPR/Cas system for genome editing, the nuclease Cas can be recruited to specific DNA region by the guiding RNA. We hope to modify the CRISPR/Cas system to recruit the DNA demethylation enzymes to specific DNA region and demethylate methylcytosines artificially. By this technology, we could analyze the biological functions of DNA methylation, investigate the effects of gene imprinting on embryo or individual development, and even correct the epigenetic mutations induced by disease and environmental factors.

在哺乳动物原始生殖细胞迁移和卵母细胞发生过程中，雌性生殖细胞经历了全局性的DNA甲基化修饰的擦除与重建。在这一过程中，疾病和环境因素不仅会干扰DNA甲基化的擦除和重建，还有可能将这种DNA甲基化突变由亲代传递给子代。随着辅助生殖技术的发展和DNA主动去甲基化机制研究的深入，建立配子DNA定点去除甲基化修饰的技术体系，已经逐渐成为可以完成的任务。CRISPR/Cas系统可以利用指导RNA将核酸内切酶特异性的靶向基因组的特定区域。我们希望借助基因组编辑系统CRISPR/Cas将DNA主动去甲基化酶募集到特定的DNA甲基化修饰区域，人为造成特定区域的DNA甲基化擦除。借用这套技术，我们可以研究DNA甲基化调控区的生物学功能，配子基因印迹对胚胎发育和个体生长的影响，甚至还可以解决由于疾病和环境造成的表观遗传编码突变引发的相关疾病。

背景：本项目旨在借助CRISPR系统的基因组靶向功能，将去甲基化酶定点引入到细胞基因组的甲基化区域，使其完成定点擦除甲基化的任务。在本项目的研究过程中，已有课题组用与本项目组设计的相同办法，完成了定点甲基化修饰和定点碱基突变的研究。因此，本项目组将主要的精力转移到了DNA损伤修复的研究上来，目的是更深一步了解基因组编辑与DNA损伤修复的关系，并深入研究生殖细胞的特殊的DNA损伤响应机制。.主要研究内容：（1）在前期工作的基础上，我们研究了TDG过表达对卵母细胞成熟的影响。（2）我们研究了卵母细胞组蛋白修饰与DNA甲基化之间的相互影响。（3）在后期我们还深入研究了卵母细胞的DNA损伤响应机制。.重要结果：（1）碱基外切修复系统的胸腺嘧啶DNA糖苷酶（TDG）本身在卵母细胞表达量极低，它的过表达会影响卵母细胞的DNA甲基化修饰和卵母细胞成熟进程。（2）培养液高浓度的葡萄糖会导致卵母细胞组蛋白甲基化水平的降低，而组蛋白甲基化的降低又影响了卵母细胞的DNA甲基化和卵母细胞的成熟。（3）卵母细胞的减数分裂重启受控于卵丘细胞，卵丘细胞控制着卵母细胞的DNA损伤响应。.关键数据及其科学意义：（1）本项目组发现过表达TDG会使卵母细胞排极体率从85%下降到30%，并且它也改变了卵母细胞的组蛋白的甲基化和DNA甲基化。这一数据揭示碱基外切修复机制影响卵母细胞的表观遗传修饰。（2）我们还发现用组蛋白甲基转移酶抑制剂BIX-01294处理卵母细胞后，卵母细胞的H3K9me2水平下降，并且排极体率从78%降到24.5%，而阻滞在前中期的卵母细胞大多出现体积变小的迹象。对卵母细胞的DNA甲基化水平的检测发现，BIX-01294处理的卵母细胞DNA甲基化略有下降。此外，我们还发现，卵母细胞的组蛋白甲基化与培养液葡萄糖含量相关，高水平葡萄糖会减少H3K9me2修饰。这些数据进一步将代谢、表观遗传和卵母细胞能力联系在一起，它也说明卵母细胞的表观修饰和体积控制都处在一个动态平衡状态下，当受到外部干扰时，会出现变化。（3）我们发现DNA损伤卵丘细胞卵母细胞复合体，卵子的核内会出现微丝，且这种现象与检验点蛋白相关。而在阻断缝隙连接时，卵子核内微丝也会出现。这些说明DNA损伤响应、卵丘细胞向卵子的代谢物的运输以及卵母细胞的命运之间存在着联系。