牛卵母细胞玻璃化冷冻导致基因组DNA甲基化降低的调控机理

A growing body of researches on embryo engineering have focused on cryopreservation affecting the epigenetic modifications in oocytes and embryos. In light of our previous study and reports, we hypothesized that the expression patterns of epigenetic modification enzymes may contribute to bovine oocyte genomic DNA hypomethylation resulting from vitrification, and subsequently alter the genomic methylation patterns in oocytes. In order to uncover the regulation mechanisms behind this process, Cryotop method was employed for bovine MII oocyte vitrification, and we performed Whole Genome Bisulfite Sequencing (WGBS) to screen key methyltransferases, demethylases and acetyltransferases, and their location change in oocyte, incorporate with reported transcriptome data on the difference between vitrified and fresh bovine oocyte. We would also investigate the DNA methylation of the promoter in key enzymes, their specific binding site in genome, the alterations in enzyme activities of them, and reveal the mechanisms of decline in genomic DNA methylation in bovine MII oocytes resulting from cryopreservation, aiming to stablize the genomic DNA methylation and improve the development potential of vitrified oocytes. This project has great scientific significance in technological innovation and theoretical development of animal embryo engineering.

卵母细胞冷冻保存引起表观遗传修饰模式的改变已成为近年来胚胎工程领域研究热点。结合已有报道和前期研究，我们推测卵母细胞玻璃化冷冻导致基因组DNA甲基化降低的可能原因是相关表观遗传修饰酶的表达模式发生改变，进而使卵母细胞基因组甲基化模式发生改变。为了进一步揭示调控机理，本项目拟以牛MII卵母细胞为对象，采用Cryotop技术进行卵母细胞冷冻，并进行全基因组甲基化测序和甲基化修饰变化分析，结合已报道的冷冻牛卵母细胞转录组数据，筛选关键去甲基化酶、甲基化酶、乙酰化酶等，并研究其表达模式和细胞定位，检测关键酶启动子区甲基化、关键酶所涉及的甲基化调控通路以及关键酶的DNA特定结合位点、酶活性调节等研究，全面解析卵母细胞冷冻导致全基因组DNA甲基化下降的机制，开发调控卵母细胞冷冻甲基化稳定以及提高冷冻卵母细胞发育潜能的有效措施。本项目的实施对动物胚胎工程技术创新和理论发展具有重要意义。

卵母细胞玻璃化冷冻导致基因组DNA甲基化水平降低，会使卵母细胞基因组甲基化模式发生改变，进而影响卵母细胞基因组的稳定性和发育潜能。解析卵母细胞冷冻引起基因组DNA甲基化降低的因素以及调控机制，对于提高卵母细胞的冷冻效果和利用，具有重要意义。本项目主要开展了四方面的研究，卵母细胞冷冻全基因组甲基化测序及差异基因的筛选；卵母细胞冷冻对基因组甲基化变化影响关键酶、蛋白表达检测；卵母细胞冷冻调控甲基化变化的机制研究；冷冻卵母细胞基因组DNA甲基化稳定或保护恢复研究。研究在冷冻卵母细胞DNA 甲基化水平、印记基因表达、调控DNA 甲基化和去甲基化酶的表达检测的基础上，进行了冷冻卵母细胞全基因组甲基化测序（WGBS），对关键基因进行了验证，结果表明卵母细胞冷冻后DNA甲基化水平降低，主要发生在基因的启动子区，外显子区和基因的上、下游区域，冷冻卵母细胞的去甲基化酶Tet3和TDG的表达异常升高，维持DNA甲基化酶 Dnmt1的表达降低。DNA损伤标志物γH2AX表达量增加，同时5hmC水平却显著下降，且γH2AX与5hmC存在共定位。通过显微注射TET3 siRNA，证实TET3基因是影响玻璃化冷冻后MⅡ卵母细胞DNA甲基化降低的主要因素。通过在卵母细胞冷冻复苏过程中添加白藜芦醇可以恢复DNA甲基化和印记基因表达，体外受精、胚胎发育观察和移植，表明卵母细胞冷冻组小鼠出生率显著低于对照组，白藜芦醇添加后提高了后代小鼠的出生率。.为了进一步提高冷冻卵母细胞的发育率和保存效果，本项目在以上关键问题研究的基础上，还开展了冷冻对卵母细胞代谢组以及关键基因、关键代谢通路的影响，取得了比较好的研究结果。本研究对于人类辅助生殖的研究以及动物种质资源的保护、利用具有重要的参考价值，对于家畜育种和畜牧生产也具有重要意义。