蒙古驴卵母细胞冻存与早期胚胎DNA去甲基化的研究

Mongolian donkeys are important draft and meat animals in the western region of China, however, compared to other economic animals like pig, cow and sheep, the analysis of mongolian donkey oocyte maturation and early embryo development is still not deep enough. Cryopreserving the mongolian donkey oocytes immediately after ovary isolation could collect numerous oocytes and avoid the damages of oocytes during long distance transportation. However, previous results showed the equine oocyte maturation rates were just 13%-16% after cryopreservation. So we want analysis the cryopreservation of mouse and pig oocytes first to improve the cryopreservation system of equine or mongolian donkey oocytes. In addition we also want to investigate the preimplantation embryo development of mongolian donkeys. The analysis of mongolian donkey oocyte cryopreservation and developmental potential is not only important to analysis the molecular mechanisms regulating mongolian donkey oocyte maturation and embryo development, but also essential for the preservation of the endangered animals and the diversity of equines.

蒙古驴是我国西部地区重要的役用和产肉动物，然而与猪牛羊等动物相比，我们对蒙古驴卵母细胞成熟和激活的研究则相对较少。对蒙古驴卵母细胞的研究主要受卵巢有腔卵泡数量少和屠宰场与实验室距离远两个因素的限制。在屠宰场即时进行驴卵母细胞的冻存，可以免去室温长途运输对生殖细胞的损害，也可以收集卵母细胞集中进行后续实验，从而使驴卵母细胞的研究成为可能。然而对马卵母细胞进行冻存的实验表明，经过冻存之后，马卵成熟率只有13%至16%。本项目拟通过对小鼠和猪卵母细胞冻存的研究，分析超速冷冻和解冻对卵母细胞质量的影响，并通过对冻存卵母细胞的研究，改善蒙古驴卵母细胞冻存技术和体外成熟的体系。此外，通过对蒙古驴成熟卵母细胞的体外受精，我们还将研究蒙古驴早期胚胎DNA去甲基化的机制。本项目不但可以探索冻存技术对卵母细胞的影响，还可以深化对马科动物卵母细胞和早期胚胎发育机理的研究，并可以为濒危野生和地方品种马科动物的保种

本项目研究了驴卵母细胞体外成熟体系与冷冻方法、玻璃化冷冻对驴卵母细胞微丝和线粒体损伤及玻璃化冷冻对蒙古驴卵母细胞DNA甲基化影响及其调控通路的分析。. 实验结果表明：1. 成熟体系中分别添加不同浓度FSH，根据成熟率的不同来分析FSH的最适浓度，结果表明添加100 μg/mLFSH、培养时间30～32 h是最佳成熟体系；切割法、 抽吸法、综合法等三种方法对未成熟驴卵泡卵母细胞进行收集，综合法是收集卵母细胞的最佳方法；20%DMSO+20%EG+60%M199+0.25M是冷冻保护液最佳配比；选用OPS管是最合适的冷冻载体。2. 冷冻卵母细胞微丝出现异常分布的数目增多，线粒体数量也明显减少；GV期冷冻卵母细胞皮质颗粒分布正常率显著低于对照，MⅡ期(GV期冷冻处理)卵母细胞皮质颗粒分布正常率显著低于对照；冷冻后卵母细胞皮质颗粒数量与密度明显低于新鲜卵母细胞，且皮质颗粒迁移受到阻滞。3. 在冷冻蒙古驴卵母细胞中，MRPL15基因甲基化水平升高，影响线粒体内的蛋白质合成；GFM1基因甲基化水平降低，该基因对于维持线粒体功能是至关重要的，并且GFM1基因在该系统中的突变导致呼吸链-氧化磷酸化系统的破坏和线粒体DNA的维持受损。. 本项目优化了驴卵母细胞体外成熟体系与冷冻方法，揭示玻璃化冷冻对驴卵母细胞微丝和线粒体等亚细胞结构的损伤并分析了玻璃化冷冻对蒙古驴卵母细胞DNA甲基化影响及其调控通路。该研究揭示蒙古驴卵母细胞早期发育机理，对提高驴卵母细胞冷冻后复活率提供理论依据，对马属动物遗传资源的保护与利用具有重要指导意义。