RBP-J依赖的Notch信号通过调控神经细胞粘附参与视网膜层次结构形成

视网膜是具有高度有序层次结构的神经组织。在哺乳类神经发育中，视网膜祖细胞（RPC）可分化出7种神经细胞并依次排列成特定的层次结构，在此基础上建立突触联系，才能完成光信号的接受、转换和传导。虽然已发现若干分子参与视网膜成层，但其调控作用的具体环节、机制及相互关系还不清楚。我们最近在国科金资助下研究RPC分化调控时发现，在小鼠RPC中特异性剔除Notch信号途径的关键转录因子RBP-J不仅引起RPC分化异常，还在视网膜发育早期出现层次结构紊乱，进一步的研究提示与细胞粘附分子表达异常有关。本课题拟以此为切入点，确定Notch信号途径在视网膜层次形成中的作用环节和调控模式，明确Notch信号作用于视网膜成层的下游分子和机制。这些研究对于深入理解视网膜形态发育的机制，阐明Notch信号在神经组织结构形成中的调控作用，以及了解相关人类疾病的发病机制，具有重要意义。

本课题前期工作在Notch信号视网膜特异性阻断小鼠上发现了视网膜层次结构紊乱与神经细胞粘附异常，拟在此基础上探明Notch信号调控神经细胞粘附的作用和机制，从而阐明经典Notch信号途径在神经系统形态形成方面的新的作用。项目在Notch下游关键转录因子RBP-J剔除小鼠上展开，包括缺陷形态学分析、Notch信号调控视网膜细胞粘附的下游基因分析、Notch信号调控视网膜细胞粘附的分子机理分析三方面的主要内容。目前已完成了RBP-J剔除小鼠视网膜层次结构缺陷形态学分析，确认Notch信号阻断后，层次紊乱的起始时间点在E13.5天，紊乱起始部位粘附连接分子N-cadherin、b-catenin表达缺位，细胞增殖减少，分化增加，而凋亡细胞数目没有显著变化；在下游基因分析方面，三次cDNA array芯片结果显示共同下调基因42个，生物信息学分析显示其中10个基因的启动子区含有RBP-J结合位点，构建10个基因的原位杂交探针行原位杂交实验显示4个基因在视网膜有明确特异性表达，进一步在敲除小鼠视网膜上行原位杂交显示其中Ttyh1和Plagl1基因在RBP-J敲除视网膜表达下调；在分子机制分析方面，通过构建Ttyh1和Plagl1启动子驱动的报告基因系统，并共转染Notch受体激活形式（胞内段）、转录因子RBP-J激活形式（RBP-JVP16），或下游基因Hes1、Hes5刺激后，发现Ttyh1启动子可被RBP-JVP16调控，而Plagl1则不存在应答。上述研究深入分析了Notch信号阻断后视网膜层次结构的缺陷表型，初步确认了Notch信号调控神经视网膜层次结构形成的下游基因，并展开了Notch信号对下游基因的调控研究。此外，由于预先设计的关于粘附连接分子的研究在cDNA array芯片结果中没有mRNA水平的变化，因此转向考虑转录后调控机制。目前，敲除小鼠视网膜的MicroRNA 芯片分析显示E14.5天敲除视网膜上调miR 33个，下调miR 14个，其中靶向粘附分子的候选miR 16 个，可作为下一步的研究方向，以期最终实现阐明Notch信号调控神经细胞粘附的作用及机制的研究目标。