Notch信号通过MicroRNA调控神经干细胞粘附连接及干性维持

In the mamalian neural development, the adherens junctions (AJs) between neural stem cells (NSCs) are the structural basis of their polarized arrangement in neuroepithelium. However, the mechanisms under the formation and remodeling of AJs remained largely unkown. Previous studies and our research works revealed that the conditional blockade of Notch signaling in neural tissues resulted in defective AJs, whereas the dowstream effectors and the regulatory loop are dimness. We accumulated Notch-blockaded neurospheres from the embryonic brain of NSC-specific knockout of RBP-J, the key transcription factor under Notch receptors. Compared with the control neurospheres, miRNA array revealed upregulation of miR-582/miR-146a. Our present data and previous reports indicate that miR-582/miR-146a could target cdh2/ctnnb1 and numb, the major components and regulator of AJs, and feedforward regulate Notch1 receptor. Based on these results, this study is aimed to demonstrate the existence and function of Notch-miR-582/146a-cdh2/ctnnb1/numb-Notch1 regulatory loop in the maintenance of the AJs and stemness of NSCs. And the accomplishment of this study could reveal the novel function and mechanisms of Notch signaling on NSCs in vivo. In addition, it might brought theoretical support to the establishment of new intervention targeting AJs structure to promote the multipotency and self-organization ability of in vitro amplified NSCs.

在哺乳类神经发育中，神经干细胞（NSCs）之间的粘附连接（AJs）是其极性排列的结构基础，而调控AJs形成及动态变化的分子机制不清。既往文献和我们的研究证明，在神经组织中特异阻断经典Notch信号后出现AJs缺陷，但其效应分子和调控环路尚不清楚。我们用Notch信号关键转录因子RBP-J条件性基因剔除小鼠培养神经球，参比正常NSC的miRNA表达谱发现：miR-582和miR-146a表达上调，前期实验和既往研究显示上述两个miRNA可靶向AJs组成分子,并前馈性调节Notch1。在此基础上，本课题拟深入研究Notch-miR-582/146a-cdh2/ctnnb1/numb-Notch1前馈环路对NSCs的AJs结构及干细胞特性的维持作用；该研究可望揭示Notch信号在体调控NSCs的新作用及新机制，还可为建立针对AJs来提升体外NSCs多潜能性及自组织能力的新的干预策略提供理论支持。

本研究从Notch信号下游microRNA分子的筛选出发，通过表达分析、体内外表型观察及上下游机制探索，揭示出miR-582-5p和miR342-5p作为Notch信号特异的效应分子对神经干细胞的调控作用与机制，为建立基于microRNA分子来提升体外神经干细胞多潜能性及体内损伤修复的应用提供了研究基础。我们在体外培养的原代神经干细胞中过表达miR-582-5p分子，发现其可促进神经干细胞的干性维持并抑制其分化。我们在体内通过经侧脑室电穿孔转染过表达miR-582-5p，发现分化后迁移的神经元减少，而放射状胶质细胞的标志分子GFAP信号增多，提示促进神经干细胞的干性维持。我们分析了miR-582-5p作用的下游分子，筛选出神经系统发育相关的LncRNA Tuna，其表达水平与miR-582-5p呈反向相关，成为进一步研究的机制分子。另一方面在miR-342-5p的研究中，我们发现miR-342-5p在神经干细胞中表达水平与Notch信号水平呈反相关，报告基因实验和染色质免疫共沉淀分析表明Notch信号的下游效应分子Hes1和Hes5可结合在miR-342-5p宿主基因EVL的启动子区并抑制其转录。在体外培养的神经干细胞中过表达miR-342-5p，其抑制神经干细胞的干性维持。通过胚胎侧脑室电穿孔转染的方法在体过表达miR-342-5p，其促进神经干细胞向中间态神经前体细胞分化。下游分子机制研究表明miR-342-5p可靶向GFAP基因调控星形胶质细胞分化。最后，抑制miR-342-5p的水平可部分挽救阻断Notch信号引起的神经干细胞干性下降，但不能挽救阻断Notch信号后的星形胶质细胞发育缺陷。上述研究内容共发表标注基金的SCI论文5篇、核心期刊1篇、获批国家发明专利1项。其中我们关于miR-342-5p的研究内容发表在JCR一区杂志，同时也是国际干细胞研究学会（ISSCR）会刊《Stem cell Repots》上。综上所述，我们已鉴定出Notch信号下游调控神经干细胞的特异性的microRNA分子，完成了既定研究目标。