结核分枝杆菌Rv2346c蛋白对巨噬细胞免疫抑制效应的机制研究

Tuberculosis is an important disease harming seriously to human health, pathogen of which is Mycobacterium tuberculosis. After M.tb infects the body, macrophages of the host exert the key immune effect on it through producing cytokines TNF-α and IL-6. However, M.tb could immunosuppress the macrophages and its mechanism remained unclear. It is found in our previous studies that: when stimulated using the Rv2346c protein secreted by M.tb, the murine macrophages displayed significant decreasing ability to secret TNF-α and IL-6 as well as to phagocytize the pathogen, and additionally the expression of mRNA of NF-κB p65 gene declined remarkably; besides, levels of miR-99b and miR-155 expression and the p38 MAPK phosphorylation elevated noteworthily. On this ground, we attempt to confirm the following mechanism via experiments in vivo and in vitro: after M.tb infect the macrophages, Rv2346c protein would activate the signal molecule p38 MAPK, thus up-regulating expression of miR-99b and miRNA-155, which would then targeting-inhibit the NF-κB gene and thereby reduce secretion of cytokine TNF-α and IL-6, consequently developing an immune-suppressive effect on the macrophages.

结核病是严重危害人类健康的重要疾病，其病原菌结核分枝杆菌感染机体后，巨噬细胞通过产生细胞因子TNF-α和IL-6对其发挥关键免疫效应。但结核分枝杆菌对巨噬细胞存在免疫抑制现象，其机制尚不明确。我们前期研究发现：用结核分枝杆菌分泌的Rv2346c蛋白刺激小鼠巨噬细胞后，巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6水平以及对结核分枝杆菌的吞噬功能显著下降，且细胞中NF-κB p65基因mRNA水平显著下降；此外，Rv2346c蛋白刺激巨噬细胞后miR-99b及miR-155表达水平显著上升，p38 MAPK磷酸化水平也显著增高。据此，我们拟通过体内外研究证实如下机制：结核分枝杆菌感染巨噬细胞后，Rv2346c蛋白活化p38 MAPK信号分子，上调miR-99b及miRNA-155的表达，后者再靶向抑制NF-κB p65基因，进而抑制细胞因子TNF-α及IL-6的分泌，从而对巨噬细胞产生免疫抑制效应。

结核病严重危害人类的健康，其病原菌结核分枝杆菌感染机体后，巨噬细胞（Mφ）通过产生细胞因子TNF-α和IL-6对其发挥免疫效应，但结核分枝杆菌对巨噬细胞存在免疫抑制现象，其机制尚不明确。有文献报道，该免疫抑制效应可能与结核分枝杆菌特有的一些蛋白有关，这些蛋白由RD区编码，而在BCG中并不存在。我们前期研究发现，结核分枝杆菌RD7区Rv2346c基因编码的分泌蛋白Rv2346c刺激小鼠Mφ后，细胞分泌TNF-α和 IL-6 的水平以及对结核分枝杆菌的吞噬功能显著下降，细胞中NF-κB p65 mRNA 水平也显著下降，且Mφ刺激后细胞中的miR-99b 及 miR-155 表达水平显著上升，p38 MAPK 磷酸化水平显著增高。据此，我们通过体内外实验进行研究论证：在体外实验中，利用重组蛋白Rv2346c刺激人和小鼠Mφ（U937、RAW264.7），观察Mφ吞噬效应、细胞因子的分泌及信号转导的改变，然后通过转染技术调控NF-κB p65、miR-99b、miR-155及p38 MAPK在Mφ内的表达，验证这些信号分子间的相互调节作用及对吞噬效应的影响；体内实验中，构建了结核杆菌分枝杆菌Rv2346c基因缺失株及回补株，经气管对C57BL6小鼠进行攻击，通过对肺组织炎症损伤、结核菌负荷及细胞因子TNF-α和IL-6的水平进行评估。实验结果证实：结核分枝杆菌感染Mφ后，Rv2346c蛋白活化 p38 MAPK 信号分子，上调 miR-99b 及 miRNA-155 的表达，后者再靶向抑制 NF-κB p65基因，进而抑制细胞因子 TNF-α及 IL-6 的分泌，从而对Mφ产生免疫抑制效应。本研究结果探明了Rv2346c蛋白系结核分枝杆菌在体内得以长期滞留的关键分子，阐明了结核分枝杆菌Rv2346c蛋白对Mφ免疫抑制的基本机制；本研究结果表明 Rv2346c 可以作为结核分枝杆菌感染的治疗靶点（可以此作为抗原开发新结核疫苗）、辅助诊断结核分枝杆菌感染等，具有潜在的重要临床应用价值。