MicroRNAs在肺泡巨噬细胞对牛结核分枝杆菌的免疫应答机制中的调控作用

微小RNA（miRNA）是一类长约21-25个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA，具有高度组织特异性、保守性和时序性，通过调控细胞因子的转录，参与调节细胞的免疫应答，在病原微生物感染时，它即是固有免疫受体活化后的信号调节分子，而且还能够直接干扰病原微生物复制而发挥抗菌效应。本项目通过构建牛肺泡巨噬细胞miRNA cDNA文库，克隆并筛选出在牛肺泡巨噬细胞特异表达的miRNA分子，并构建特异性miRNA分子的siRNA表达载体，研究miRNA分子对巨噬细胞增殖、凋亡和细胞因子表达量的变化；同时建立牛结核分枝杆菌卡介苗(BCG)毒株与肺泡巨噬细胞、小鼠Raw264.7巨噬细胞相互作用的模型，研究miRNA在牛结核分枝杆菌与肺泡巨噬细胞的免疫应答机制中的调控作用，从细胞和分子水平上解析牛结核病发生过程中宿主肺泡巨噬细胞的免疫应答机制与致病机理，同时为控制牛结核疾病的发生提供基础资料和理论依据。

本项目严格按照项目计划书进行，完成了全部的内容，主要成果如下：.1.构建了两个牛肺泡巨噬细胞miRNA cDNA文库，并挑取了438个克隆，经过测序比对分析，共筛选出25个miRNAs，其中Bta-miR-21、Bta-miR-203、Bta-miR-149、 Bta-miR-155、Bta-miR-146、Bta-miR-142等14个miRNAs与天然免疫应答相关，另外有11个miRNAs在所有 miRBase 数据库中都没有发现，其功能尚属未知。.2.通过建立 BCG与RAW264.7肺泡巨噬细胞相互作用的模型研究发现，BCG进入RAW264.7肺泡巨噬细胞后，能够引起miRNAs表达发生显著性变化，miRNAs的表达改变，会引起下游靶基因表达的改变，这些miRNAs可能通过调控免疫相关基因在巨噬细胞抗结核分枝杆菌的免疫应答中发挥着重要的作用。.3.通过构建miR-149、 miR-203和miR-142-3p shRNA慢病毒过表达载体并包装成病毒颗粒，用miR-149、 miR-203和miR-142-3p慢病毒、BCG和LPS分别刺激RAW264.7细胞，Western blot检测结果表明，miR-149和miR-203可靶向抑制TLR/MyD88/NF-κB信号通路中关键的接头分子MyD88蛋白的表达，Real Time PCR检测结果显示，miR-149和miR-203引起MyD88下游基因NF-κB、TNF-α和IL-6 mRNA表达下调（p<0.05）。说明miR-149和miR-203可靶向调控TLR/MyD88/NF-κB信号通路中关键的接头分子MyD88蛋白，参与结核分枝杆菌与肺泡巨噬细胞的免疫应答反应。miR-142-3p可以直接靶向作用于IRAK-1的3’UTR，抑制IRAK-1的表达；过表达miR-142-3p不仅使IRAK-1表达显著下降，而且可抑制IRAK-1下游基因NF-κB、TNF-α、IL-6的表达；抑制miR-142-3p的表达，IRAK-1基因的表达相应升高，其下游基因NF-κB、TNF-α、IL-6的表达也相应的升高。结果证明，miR-142-3p可以直接靶向调控IRAK-1的表达，通过TLRs/IL-1R通路介导结核分枝杆菌与巨噬细胞的炎性反应，负向调控结核分枝杆菌与RAW264.7巨噬细胞的免疫应答反应。