Atg5与Atg12在激素性股骨头缺血坏死中作用及siRNA-Atg12对其影响的实验研究

Steroid-induced avascular necrosis of femoral head(SANFH) which pathogenesis remains unclear had a complex biological process. With the recent development of molecular biology ，autophagy is a major research issue which is related with the pathogenesis of aging and death and injury in recent years. Our previous study showed that Beclin1 and MAP1LC3 was high expression SANFH. Speculated that the autophagy was correlation with the development of SANFH. The project based on previous issues, intends to through animal models and cell culture and by autophagy as an entry point, using of immunofluorescence and electron microscopy methods to detect autophagy of osteocytes and osteoblasts, while using of RT-PCR and western blotting methods to detect mRNA and protein expression of Atg5 andAtg12 then the siRNA- Atg12 was injected to experimental animals and imported to osteoblasts in vitro in order to control the biological process.The object is to further explain the pathogenes of SANFH.

应用肾上腺皮质激素引起的股骨头缺血坏死(SANFH)具有复杂的生物学过程，其发病机制仍不清楚。随着近年来分子生物学的发展，自噬型细胞死亡已成为研究组织器官衰老、死亡、损伤等发病机制的重要研究方向。我们的近期实验发现：Beclin1、MAP1LC3在SANFH中表达增加，提示自噬可能在SANFH中发挥着重要作用。推测自噬上游调节基因Atg5与和Atg12亦与SANFH存在关联。本项目拟在前一课题基础上，以自噬型细胞死亡为切入点，通过动物模型及成骨细胞培养，利用免疫荧光标记、透射电镜观察等方法检测骨细胞、成骨细胞自噬型细胞死亡情况，同时利用RT-PCR、western blotting等方法检测Atg5和Atg12的mRNA与蛋白表达；并通过实验组动物注射及体外培养的成骨细胞转染siRNA- Atg12来调控这一生物学过程。进一步探讨SANFH的发病机制。

项目背景：应用肾上腺皮质激素引起的股骨头缺血坏死(SANFH)具有复杂的生物学过程，其发病机制仍不清楚，临床上缺乏行之有效的治疗手段。因此，探明SANFH的病因学机制，仍然是该领域研究的重要内容。随着近年来分子生物学的发展，自噬型细胞死亡已成为研究组织器官衰老、死亡、损伤等发病机制的重要研究方向。.主要研究内容：我们的前期实验发现：Beclin1、MAP1LC3在SANFH中表达增加，提示自噬可能在SANFH中发挥着重要作用。推测自噬上游调节基因Atg5与和Atg12亦与SANFH存在关联。本项目在前一课题基础上，以自噬型细胞死亡为切入点，通过动物模型及成骨细胞培养，利用免疫荧光标记、透射电镜观察等方法检测骨细胞、成骨细胞自噬型细胞死亡情况，同时利用RT-PCR、western blotting等方法检测Atg5和Atg12的mRNA与蛋白表达；并通过实验组动物注射及体外培养的成骨细胞转染siRNA- Atg12来调控这一生物学过程。.主要结果:该项目在体实验发现：1.在SANFH模型中存在骨细胞、成骨细胞过度的自噬型细胞死亡；2.在SANFH模型中存存在骨细胞、成骨细胞Atg5与Atg12基因表达增强，同时通过siRNA- Atg12能部分抑制Atg12蛋白活性，阻断自噬体形成,并能减少骨细胞、成骨细胞自噬发生；3.siRNA- Atg12能抑制骨细胞、成骨细胞自噬型细胞死亡，说明 Atg5与Atg12基因表达增强与SANFH存在一定关联，siRNA- Atg12能部分逆转SANFH。该项目离体实验发现：1.证实激素可以诱导成骨细胞自噬；2.激素作用离体成骨细胞实验的最佳检测浓度应大于10-8mol/L，浓度为10-6mol/L的情况下，随着地塞米松作用时间的增加，离体成骨细胞的自噬发生逐渐增多；3.随着自噬增多，Atg5、Atg12、Beclin1、MAP1LC3随着激素作用时间的增加，表达逐渐增多；4.过度的细胞自噬可能是引起SANFH的重要风险因素之一。.科学意义：该项目为以后的研究提供了实验基础，同时通过证实细胞自噬延长阶段基因的高表达可能为激素性骨坏死发病机制，且其强度与激素作用的时间存在相关性，为进一步SANFH发病机制研究与防治提供理论基础。