自噬基因Beclin1与MAP1LC3在激素性股骨头缺血坏死中的作用及3-MA对其影响的实验研究

Steroid-induced avascular necrosis of femoral head(SANFH) which pathogenesis remains unclear had a complex biological process. Autophagy is a major research issues which is related with the pathogenesis of aging and death and injury in the field of medicine in recent years. Our previous study showed that the femoral head ischemia and hypoxia which caused by PDGF and VEGF inhibition in segmental vessels of the femoral head and the regulation of a number of differentially genes expressed in association with the occurrence of SANFH. Speculated that the autophagy was correlation with the development of SANFH. The project based on previous issues, intends to through animal models and cell culture and by autophagy as an entry point, using of immunofluorescence and electron microscopy methods to detect autophagy of osteocytes and osteoblasts, while using of RT-PCR and western blotting methods to detect mRNA and protein expression of MAP1LC3 and Beclin1, then the 3-methyladenine(3-MA) was injected to experimental animals and imported to osteoblasts in vitro in order to control the biological process.The object is to further explain the pathogenes of SANFH.

应用肾上腺皮质激素引起的股骨头缺血坏死(SANFH)具有复杂的生物学过程，其发病机制仍不清楚。自噬型细胞死亡已成为近年来医学领域研究组织器官衰老、死亡、损伤等发病机制的重要研究方向。我们的前期研究结果表明：激素对股骨头节段血管中PDGF与VEGF的抑制而引起的缺血缺氧状态及其众多差异表达基因的调控与SANFH发生存在关联性。推测由激素导致SANFH发生过程中极有可能存在细胞自噬型死亡这一生物学特性。本项目拟在前一课题基础上，以自噬型细胞死亡为切入点，通过动物模型及成骨细胞培养，利用免疫荧光标记、透射电镜观察等方法检测骨细胞、成骨细胞自噬型细胞死亡情况，同时利用RT-PCR、western blotting方法检测Beclin1与MAP1LC3的mRNA与蛋白表达；并通过给实验组动物注射及给体外培养的成骨细胞导入3-甲基腺嘌呤（3-MA）来调控这一生物学过程。进一步探讨SANFH的发病机制。

激素引起的股骨头缺血坏死（SANFH）主要累及中青年，多为双侧性，坏死范围广，病情远较一般的特发性股骨头缺血坏死严重，致残率极高，SANFH具有复杂的生物学过程，其发病机制仍不清楚，临床上缺乏行之有效的治疗方案。自噬型细胞死亡已成为近年来医学领域研究组织器官衰老、死亡、损伤等发病机制的重要研究方向，本项目以自噬型细胞死亡为切入点，通过动物模型及成骨细胞培养，利用免疫荧光标记、透射电镜观察等方法检测骨细胞、成骨细胞自噬型细胞死亡情况，同时利用RT-PCR、Western blotting方法检测Beclin1与MAP1LC3的mRNA与蛋白表达；并通过给实验组动物注射及给体外培养的成骨细胞导入3-甲基腺嘌呤（3-MA）来调控这一生物学过程。在体研究结果：HE 染色证实家兔SANFH模型制造成功，实验组空骨陷窝数量明显多于对照组（P<0.05）；免疫组化结果中实验组Beclin 1和MAP1LC3的阳性率分别为96.43%、92.86%，明显高于对照组16.67%、8.33%（P<0.05）；Western blotting结果表明实验组Beclin 1及MAP1LC3蛋白比对照组表达增高（P<0.05）。离体研究结果：激素明显抑制MC3T3-E1细胞增殖活性，使得细胞G0/G1期阻滞，且呈浓度依赖性；与对照组相比，随着激素浓度增加，PARP凋亡蛋白表达呈明显增加的趋势，细胞内ROS水平逐渐增多，ATF4和CHOP蛋白表达呈明显增加的趋势，激素诱导了MC3T3-E1细胞内质网应激的发生（P<0.05）；与对照组相比，LC3-2/LC3-1比值随激素浓度增加而增大，证实激素诱导了MC3T3-E1细胞自噬的发生，并且激素通过ROS诱导了凋亡和自噬的发生，当ROS被抑制时，细胞凋亡和自噬现象明显减少，加入3-MA后细胞自噬被抑制，凋亡亦被抑制（P<0.05）。综上，该实验研究结果表明：在早期SANFH动物模型中，自噬基因Beclin 1和MAP1LC3的表达增高，骨细胞和成骨细胞自噬参与了SANFH的发病；激素促进了ROS产生，进而激活了内质网应激，介导细胞凋亡和自噬增强，最终导致SANFH的发生，3-MA具有部分逆转效应。本项目证实了自噬与SANFH之间存在关联，为其病理学机制的进一步研究奠定基础，从而为SANFH的防治提供新的思路和方法。