不同克隆群热带假丝酵母菌毒力特征及其编码基因遗传规律的研究

Candida tropicalis has become one of the most important non-albicans Candida causing nosocomial infections. Adhesion and biofilm formation, enzymes secretion and haemolytic activity are considered as the main virulence factor.The DNA sequences of virulence factor are deficiency, and study of its molecular pathogenesis and interaction with host cell is in initial stage. It has been reported that the virulence of C.tropicalis is strain-denpedent. We have studied the population structure of C.tropicalis using Multilocus Sequence Typing (MLST). Three independent clonal complex from China Mailand and 52 new DST types were produced. In this study, we intend to find the genetic character of virulence genes form different clonal complex by molecular biology and bio-informatics methods; to compare virulent activity among different complex using series of experiments; and to study the invasiveness,host cell damage of dictict complex strains when infect the TCC-SUP cell line, and compare the expression level of virulence genes between culture and invasive condition. The accomplishment of this research will help to select the dominant virulent complex,clarify the molecular basis for virulence disparity and will be quite important for further epidemiology monitoring, prevention, diganosis and treatment of Candida tropicalis.

热带假丝酵母菌已成为医院内感染的重要非白假丝酵母之一。公认黏附和生物膜形成，分泌多种水解酶和溶血活性是其重要毒力因子。目前缺乏热带假丝酵母毒力基因的序列信息，其分子致病机制，与宿主细胞相互作用的研究尚在起步阶段。研究表明热带假丝酵母的毒力有高度菌株差异性。我们前期应用多为点序列分型技术研究了热带假丝酵母种群结构特征，发现来自中国大陆的菌株形成3个独立优势克隆群和52个全新DST型别。本研究拟采用分子生物学和生物信息学方法研究不同克隆群菌株毒力编码基因的遗传结构特征；通过一系列实验观察不同克隆群菌株的毒力活性；并借助细胞生物学，免疫组化，反转录等研究手段观察比较优势克隆群菌株在纯培养和侵袭感染人膀胱上皮细胞(TCC-SUP)时，侵袭性的强弱，宿主细胞破坏程度和毒力基因表达水平的变化。本研究工作的完成有助于筛选毒力的优势克隆群，阐明毒力差异的分子基础，对其流行病学监测、预防、和诊疗有重要意义。

热带假丝酵母菌已成为医院内感染的重要非白假丝酵母之一。公认黏附和生物膜形成，分泌多种水解酶和溶血活性是其重要毒力因子。目前缺乏热带假丝酵母毒力基因的序列信息，其分子致病机制，与宿主细胞相互作用的研究尚在起步阶段。因此，本课题通过一系列实验观察不同克隆群菌株的毒力活性,并比较优势克隆群菌株在纯培养和侵袭感染人膀胱上皮细胞(TCC-SUP)时，侵袭性的强弱，宿主细胞破坏程度和毒力基因表达水平的变化。研究发现64株热带假丝酵母菌在培养24、48和72小时均具有天冬氨酰蛋白酶活性和溶血活性，且随着时间的延长其活性持续增长，但均未表现出磷脂酶活性。此外，应用XTT和CV实验评价热带假丝酵母菌在聚丙烯非生物材料表面和人膀胱癌上皮细胞表面的黏附和生物膜形成能力，结果显示分离自血液的菌株呈现较低的黏附和生物膜形成能力，却具有强的天冬氨酰蛋白酶活性。MLST聚类种群中group5和6为高黏附和生物膜形成株聚集，而group1为低活性菌株聚集。在此基础上，我们挑选出9株不同毒力活性的代表株，进一步观察其菌丝形成能力，毒力基因（ALST1-3, LIP1, LIP4, and SAPT1-4）的表达情况，以及宿主细胞破坏程度。结果显示菌株ZRCT45具有强菌丝形成能力，ZRCT52在体外诱导时不能形成菌丝，且LDH实验显示ZRCT52的细胞破坏程度最弱。RT-PCR显示ALS3和SAPT3基因表达量最高。数据分析提示ALST2-3基因的表达和细胞破坏程度显著相关。除ALST3基因外，其余基因在TCC-SUP的表达都高于浮游状态。除此之外，实验结果还提示TCC-SUP表面的黏附和细胞破化程度呈正相关。但血源分离株FXCT01是个例外，它的细胞破坏程度最强却表现中等黏附能力。本研究工作的完成有助于筛选毒力的优势克隆群，阐明毒力差异的分子基础，对其流行病学监测、预防、和进一步研究其侵袭感染机制有重要意义。