黄瓜西瓜花叶病毒抗性基因wmv的克隆及功能解析

Watermelon mosaic virus (WMV) is an important virus for cucumber (Cucumis sativus L.) production. It can cause significant reduction in yields. The most effective method for controlling this virus in cucumber is the use of resistant varieties. However, there are no important breakthroughs in the molecular studies about resistance of WMV in cucumber. Thus the molecular marker assisted selection (MAS) for WMV resistance breeding is limited. In previous studies, we detected four NBS resistant genes in the fine-mapping region of the resistance gene to WMV (wmv). This result lays firm base for mining the wmv gene and making clear its function. In this project, we will conduct map-based cloning of the wmv gene based on sequence information of cucumber whole genome and re-sequencing for core germplasm. Function analysis for the wmv gene will also be conducted using transgene technology and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. RNA-Seq data will provide information on the gene expression profile and gene pathways map. Furthermore，the molecular evolution in cucurbitceace family will be also investigated in this study. The objectives of the present study were to mining the key genes controlling the WMV resistance of cucumber and establish a new germplasm. The results of the present study have significant impact on exploring the molecular mechanism of the WMV resistance, and it can provide academic guidance and practical molecular markers to the resistance breeding program.

西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus, WMV）是为害黄瓜生产的主要病毒，由于生产上缺乏行之有效的防治方法，常造成减产甚至绝收，选育抗病品种是解决WMV为害最经济有效的途径。利用分子标记辅助育种可大大加速抗病育种进程，但是由于WMV抗性基因基础研究滞后限制了抗病分子育种的发展。针对上述问题，项目组前期已精细定位wmv基因，并发现4个抗病候选基因，为深入挖掘抗病基因并解析其功能。本项目拟充分挖掘基因组及重测序信息，克隆黄瓜抗西瓜花叶病毒基因wmv；通过比较基因组学研究抗病基因分子进化及起源，利用亚细胞定位、过量表达、CRISPR/Cas9基因组编辑、RNA-Seq等技术分析基因功能，并创制抗病新种质。本研究不仅对明确抗病基因的功能及调控分子机理具有重要意义，同时可以为抗WMV分子育种及创新抗病种质资源提供理论依据和实用分子标记。

黄瓜西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus, WMV）是黄瓜生产上的主要病毒，但生产上缺乏有效的防治方法，常造成减产甚至绝收，因此选育抗病品种才是解决WMV为害的有效途径。而WMV抗性基因研究滞后严重限制了抗病分子育种的发展。针对上述问题，项目组克隆了黄瓜抗西瓜花叶病毒基因CsWMV；开展了亚细胞定位、RNAi沉默、转录组测序、CRISPR/Cas9基因编辑等技术分析验证基因功能，并创制筛选抗病种质。 .研究发现黄瓜抗西瓜花叶病毒基因CsWMV编码淀粉合成的限速酶ADP-葡聚糖焦磷酸化酶（AGPase），其活性的大小控制淀粉合成的速率，最终决定淀粉合成量的多寡。当接种WMV病毒40小时后该基因在抗病材料中的表达显著上调，且淀粉粒数目明显多于感病材料。进一步分析发现在病毒侵染后植病互作通路的基因被显著富集到，这些基因均属于钙信号通路，并且在病毒侵染后显著上调。上述结果说明钙信号通路和糖代谢通路均可能参与了黄瓜对WMV的抗性。还获得T0突变体10株，并从中筛选出抗病性状能够稳定遗传的两种编辑类型的纯合突变体。利用新开发的功能性分子标记结合抗病鉴定筛选出性状优良具有西瓜花叶病毒病抗性的新种质。.本研究结果不仅从分子水平初步揭示了CsWMV基因在黄瓜WMV抗性中的分子机理。新开发的功能性分子标记也已广泛应用于黄瓜抗西瓜花叶病毒病的分子育种中，极大提高了选育效率。研究结果也为深入应用基因编辑技术创新黄瓜抗病种质提供理论依据及技术保障。