来那度胺治疗多发性骨髓瘤的分子机制研究

Multiple myeloma (MM) is a B-cell malignancy characterized by abnormal growth of plasma cells. Currently, multiple myeloma is incurable although it can be treated clinically by thalidomide, lenalidomide, pomalidomide, or the combination of several drugs. However, the exact molecular mechanisms which are responsible for the treatment of this disease are not known yet. Recently, it has been found that thalidomide inhibits the activity of an E3 ubiquitin ligase complex, DCX(CRBN), composing of DNA damage binding protein 1, Cullin 4A, X-Box protein, and cereblon (CRBN). Thalidomide suppresses the ubiquitination of CRBN, an adaptor protein which recognizes the substrates of the E3 ligase. Our preliminary experiments demonstrated that lenalidomide, a more potent anti-myeloma drug and an analogue of thalidomide, also suppresses the ubiquitination of CRBN. This finding suggests that it is highly likely that the treatment of multiple myeloma by lenalidomide is directly linked to protein ubiquitination...In this application, we will use our newly developed technology, ubiquitin remnant immunoaffinity profiling, quantitative proteomics, and biochemical approaches to study the molecular mechanisms of lenalidomide in the treatment of multiple myeloma. Using quantitative proteomics, we will reveal the dynamics of protein ubiquitination and discover the ubiquitination events which are differentially regulated in the treatment of multiple myeloma by lenalidomide. We will further validate these ubiquitination events using mutagenesis and biochemical approaches, and identify key events which are responsible for the killing of myeloma cells during disease treatment. Through this study we will unravel the molecular mechanisms in the treatment of multiple myeloma by lenalidomide. The expected finding from this project can help us pave a new avenue to design novel therapeutic drugs or approaches for the treatment of myeloma, and thus to avoid drug resistance and reduce side effects that thalidomide and lenalidomide have in multiple myeloma patients.

多发性骨髓瘤是浆细胞异常增生的恶性肿瘤。迄今为止，仅可用沙利度胺、来那度胺等几种药物进行治疗，但其治疗的分子机制尚未阐明，且几乎所有病人都对这些药物有抗药性。最近研究发现沙利度胺是一种泛素连接酶的抑制剂，并抑制CRBN蛋白的泛素化。我们的预实验显示来那度胺也抑制CRBN的泛素化。根据预实验结果我们推测：来那度胺治疗多发性骨髓瘤的机制极有可能与蛋白泛素化有直接关联。为证实这一假说，本课题将采用申请人新建立的蛋白泛素化位点鉴定技术，结合定量蛋白质组学及生物化学方法来探索来那度胺治疗多发性骨髓瘤的分子机制。通过定量蛋白质组学和泛素化位点鉴定技术找到调控肿瘤细胞凋亡的关键蛋白泛素化；应用定点突变和生物化学方法验证关键蛋白的泛素化，揭示其在治疗多发性骨髓瘤过程中的分子机制。通过这些研究，期望为这一疾病的治疗提供新靶点，并设计新化合物对疾病进行有效治疗，从而避免或减轻病人对药物的抗药性，并降低副作用。

多发性骨髓瘤是第二大血液肿瘤，迄今为止还不能被治愈。自1995年来，沙利度胺、来那度胺及其结构类似物被用于治疗多发性骨髓瘤，取得了良好的疗效，但其作用的分子机制尚不明确。在本课题的研究中，我们通过蛋白质组学、免疫沉淀、免疫印迹、免疫荧光、病毒感染、细胞增殖等方法发现了一个来那度胺等免疫调节药物调控骨髓瘤细胞死亡的新机制。首先我们证实了沙利度胺主要靶蛋白cereblon (CRBN)与cullin 4A、ROC1和DDB1形成一个Cullin-RING E3 Ligase (CRL4)-CRBN泛素连接酶复合体，但来那度胺及其结构类似物并不影响该E3泛素连接酶复合体的稳定性。但这些药物可以抑制CRBN上K48位多聚泛素链的形成，使其泛素化程度大大降低，并抑制蛋白酶体对其降解，从而提高CRBN蛋白质的稳定性和表达水平。我们进一步利用泛素化位点鉴定技术发现了CRBN的多个泛素化位点，并通过免疫沉淀和免疫印迹等生化实验证实了这些泛素化位点和所在结构域对CRBN泛素化的影响。通过在骨髓瘤细胞中研究已知CRBN相互作用蛋白BKCa的mRNA和蛋白水平，我们发现这些药物可以增强CRL4-CRBN E3泛素连接酶活性，澄清了之前提出的沙利度胺抑制该泛素连接酶活性的不当论断。利用表达对照和CRBN的慢病毒颗粒感染后建立的骨髓瘤细胞株，我们发现CRBN高表达的骨髓瘤细胞株对这类药物更敏感。综上所述，通过质谱分析和生化实验我们发现了一个通过抑制E3泛素连接酶底物受体的泛素化，增加其稳定性和蛋白水平，提高E3泛素连接酶活性，泛素化降解其底物蛋白质，从而杀死骨髓瘤细胞的一个新的分子机制。我们的研究结果也证实来那度胺及其结构类似物是一类新型的E3泛素连接酶激活剂，这一机制有可能可以作为调控E3泛素连接酶活性的一个新策略。在本课题研究过程中，我们及时了解该领域的最新研究进展，并拓展了研究内容，我们还对CRBN及其导致智力发育迟滞的突变体蛋白的稳定性、活性和泛素化调控的机制进行了探索，对CRBN调控的下游蛋白质进行了定量蛋白质组学的分析。这一课题的研究对多发性骨髓瘤治疗新策略的探索提供了一定的理论基础。研究结果共发表署项目号论文12篇，其中SCI论文9篇，二区及以上5篇，申请中国专利一项，培养研究生8名。