泛素连接酶底物受体cereblon及其突变体调控神经发育机制的研究

Statistic data from the second national survey of disabled people indicates that more than eight million people in China have different degree of mental retardation. This will cause tremendous pressure on the treatment and care for these patients. Mental retardation is mainly caused by heterogeneous genetic defects, such as cereblon (CRBN). This mutation introduces a premature stop codon in CRBN and produces a protein that loses the C-terminus of the mature protein. Studies from our and other groups demonstrated that CRBN can function as a substrate receptor to form an E3 ubiquitin ligase complex. Our preliminary experiments discovered that proteins related to neuronal development were regulated by CRBN. Therefore, we reason that CRBN regulates neuronal development through its downstream targets. In order to test this hypothesis and to elucidate the molecular mechanism by which CRBN regulates neuronal development, we will apply a quantitative proteomic approach to identify proteins regulated by CRBN and its nonsense mutant. We will also identify proteins which differentially interact with CRBN and its mutant. We will then explore the mechanism by which CRBN regulates neuronal development in cell lines and primary neuronal cells using biochemical techniques such as protein overexpression, siRNA silencing, Western blotting, immunofluorescence, etc. We expect that this study will elucidate the mechanism by which the CRBN mutation causes mental retardation and provide potential molecular targets for drug discovery.

第二次全国残疾人抽样调查统计数据显示我国超过八百万人有不同程度的智力发育缺陷，这是对医疗和护理的一个重大挑战。大部分智力发育缺陷是由遗传因素引起的，如cereblon (CRBN)等。我们和其他课题组之前的研究发现CRBN作为底物受体与DDB1、cullin 4A、ROC1等蛋白质组成一个泛素连接酶复合物，我们的预实验还发现CRBN可以调控神经发育相关蛋白质的表达，我们推测CRBN是通过其下游蛋白质调控神经发育的。为了证明这一假说并阐明其分子机制，我们将在本申请中利用定量蛋白质组学技术筛选由CRBN及其突变体差异调控的蛋白质和不同相互作用的蛋白质；并利用生物信息学分析、蛋白质过表达、基因敲低、免疫沉淀、蛋白质印迹、免疫荧光等研究方法在细胞株和小鼠神经元中探索CRBN调控神经元生长的分子机制。该研究有望阐明CRBN突变引起智力发育迟滞的原因，为药物研发提供潜在的靶点。

第二次全国残疾人抽样调查数据显示我国超过八百万人有不同程度的智力发育缺陷，其中有一大部分是由遗传因素引起的。已有研究发现Cereblon（CRBN）突变可以引起不同程度的智力发育迟滞，但其作用的机制还不清楚。我们和其他课题组前期研究发现CRBN可以作为一个Cullin-4 RING E3泛素连接酶的底物受体调控下游蛋白的水平，因此我们思考CRBN是通过其E3泛素连接酶底物受体还是通过其非酶作用来调控神经发育和神经保护的呢？在本课题中，我们首先利用细胞培养稳定同位素标记（SILAC）定量蛋白质组学技术筛选了受CRBN调控的下游蛋白，获得了多个与神经发育和细胞凋亡相关蛋白，如HUWE1、UBE2T、c-Jun等。其次，我们利用生物化学实验验证了CRBN对关键蛋白c-Jun的调控及其相互作用，发现了其调控的分子机制，进一步阐明了CRBN通过c-Jun调控炎症和细胞死亡的功能及其机制。而CRBN突变对下游蛋白的调控与野生型CRBN显著不同，突变体可能通过该作用调控神经发育和神经保护功能。然后，我们又发现CRBN通过其非酶作用达到神经保护的功能。通过蛋白质相互作用分析发现CRBN与多功能蛋白sequestosome 1/p62结合从而抑制p62与泛素化蛋白的结合，抑制致病蛋白聚集体的形成，缓解神经元的死亡。我们还发现CRBN竞争性抑制p53与抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的相互作用；细胞系、原代细胞和模型小鼠在体实验发现用DNA损伤药物依托泊苷处理后，CRBN缺失使p53与Bcl-2和Bcl-XL作用增强，从而降低细胞线粒体膜电位，激活凋亡酶3，促进对PARP1的剪切，进而加速神经细胞的死亡。另外，我们的研究还发现caspase 8可以剪切CRBN的氨基端，促进CRBN截短体的泛素化降解；在细胞系和原代细胞中敲低或抑制caspase 8可以增加骨髓瘤细胞对免疫调节药物来那度胺的敏感性。综上所述，本课题的研究阐明了CRBN通过其E3泛素连接酶底物受体和非酶作用来实现其对细胞的保护功能，为探索疾病治疗新策略提供了研究基础。在本项目的支持下，共发表标注项目号SCI论文12篇，其中中科院二区论文8篇（3篇自然指数期刊J Biol Chem），一篇J Biol Chem和一篇FEBS J被选为封面论文，获授权发明专利1项；培养硕士研究生10名，博士研究生1名，完成了预期目标。