新型DNA 序列选择性双嵌入剂的合成及生物活性研究

DNA bisintercalators are normally used to improve the anticancer activity of drug molecules. However, their applications are limited due to lack of sequence selectivity.We have previously synthesized some novel PNA monomer analogue and amides spacer based bisinteracalators and found that they exhibit effective selective binding ability to CG squence. However, the anticancer activity was ignored. Following the previous preliminary success, we have proposed in this project to design and synthesize a series of bisintercalators with different oligopeptide spacers between the two intercalative groups. These bisintercalators can be classified as two categoris: bisintercalators with and without threading intercalative group. Various amino acids, diamines or naphthalimides will be used to modify the spacers of the bisintercalators. CG rich regin of c-Myc sequence binding ability of the bisintercalators, which is affected by spacer length, flexibility, with or without threading intercalative group in the bisintercalators will be investigated by UV-Vis, fluorecsence, NMR, gel electrophoresis, while the effects on the anticancer activity and mechanism result from bisintercalator will be studied by means of MTT, FCM and RT-PCR. Successful completion of this project will provide us with more experience on the design and synthesis of sequence selective binding bisintercalators. It is also beneficial to our further study in regulation of cancer cell gene expression.

DNA双嵌入型结构常用于提高药物分子的抗肿瘤活性，然而，由于缺乏序列选择性使其应用受到限制。在前期工作中，我们合成了基于肽核酸单体的双嵌入剂，研究发现，酰胺键连接两个嵌入基团而得到的双嵌入剂能够有效提高化合物对CG序列的选择性结合能力，但未研究其抗肿瘤活性。因此，本项目拟在此基础上设计以寡肽骨架连接两个嵌入基团，分别合成含螺纹嵌入基团和不含螺纹嵌入基团的两大类DNA双嵌入剂。在双嵌入剂中引入不同的氨基酸及二胺类或萘二酰亚胺改变桥链结构，以紫外、荧光、核磁、凝胶电泳等手段系统研究桥链结构的长度、刚柔性及螺纹嵌入基团的引入对c-Myc基因启动子富CG区域选择性结合能力的影响，并且用MTT法、流式细胞仪及RT-PCR研究双嵌入剂的抗肿瘤活性及抗肿瘤细胞作用的机制。本项目完成后，可以为序列选择性DNA结合小分子的设计提供经验和基础，并为进一步进行肿瘤细胞基因调控提供有效的武器。

DNA选择性结合药物的研究是一个非常活跃和多学科交叉的研究领域。一些能够与DNA进行序列选择性结合的分子与 DNA 结合而抑制转录因子，从而达到调节基因表达进而抑制肿瘤细胞生长的作用。我们通过设计合成以手性氨基酸及不同二胺为桥连结构共合成新的DNA双嵌入剂6大类共37个，采用了紫外可见滴定、荧光滴定、粘度滴定及核磁滴定等方法系统性研究了它们与小牛胸腺CT DNA的结合能力及结合模式，并从中选出一个模型化合物研究其与[Poly(dA)-Poly(dT)]、AT box、[Poly(dC)-Poly(dG)]和CG box四种具有不同序列的DNA的结合能力。对所有合成的化合物，我们通过MTT法对食管癌、胃癌、肝癌等癌细胞进行了活性筛选，在此基础上选择了部分化合物进一步进行细胞凋亡及RT-PCR实验，研究了化合物2d和3c对BGC823细胞中C-myc、Caspase、P53、Bcl-2基因的表达的影响。实验结果显示，化合物的结构对其与DNA间的作用模式及结合常数有着很大影响。即便是同一系列不同结构化合物，其与CT DNA间的结合模式也可能为双嵌入模式、部分嵌入模式或沟结合模式，结合常数也相当大的变化，最大值与最小值间可能相差20倍。以2a为模型化合物研究了其对DNA的序列选择性结合能力，发现其对富含AT碱基对的DNA链具有较高的结合常数，对不同序列DNA间的结合常数最大差异近10倍。采用Annexin V-FITC/PI双染法进行细胞凋亡实验发现，即便同一系列不同结构化合物诱导细胞凋亡的结果都有不同，早期凋亡和晚期凋亡均有出现。RT-PCR实验显示，由于化合物对富含AT序列DNA具有选择性结合能力，不能够有效抑制c-myc mRNA表达。通过本项目的开展我们了解了双嵌入剂中桥连结构及取代基团对其与DNA间结合能力的影响，适度的链长及适度的刚柔性有助于提高双嵌入剂与DNA间的结合能力，桥连基团中取代基也会影响双嵌入剂与DNA间的结合模式和结合常数，特别是在较大取代基存在性，结合模式不再是双嵌入模式，结合常数也有较大程度下降。但是，与DNA间结合能力不能够影响抗肿瘤活性，这可能因为较大取代基具有更为适合的酯水分配系数，有利于透过细胞膜有关。