高效诱导人表皮干细胞向成釉质细胞分化及其机制研究

It is a promising, valuable and effective research for human tooth tissue regeneration. Despite many attempts, however, postnatal stem cells have not been used successfully as the epithelial component in the generation of a bioengineered tooth. Our studies have firstly confirmed that human keratinocyte stem cells, in the presence of FGF8 signal and when recombined with mouse embryonic dental mesenchyme, are able to participate in tooth development, and can be induced into differentiate to enamel-secreting ameloblasts. Which indicating that human keratinocyte stem cells can be used as a source of human epithelial stem cells for future tooth regeneration, however, the efficiency of tooth formation is rather low. The purpose of this project is to improve the efficiency and study the molecular mechanism of induction of human keratinocyte stem cells into ameloblasts. It contains two parts (1) Improving the efficiency of induction by enhancing FGF8 signal or increasing the Wnt/beta-catenin signals on human keratinocyte stem cells; (2) Searching for downstream target genes for PITX2 to study the molecular mechanism of induction of human keratinocyte stem cells into ameloblasts. The result will provide more scientific basis for identify human keratinocytes as a potential cell source for in vitro generation of bioengineered teeth that may be used in replacement therapy.

人类牙齿器官再生是一项极具应用前景、市场价值和社会效益的研究工作，然而寻找适合于牙齿再生的上皮源性的成体干细胞仍是该领域的难题之一。我们的前期研究在本领域首次证明，在具有成牙潜能的牙胚间质的支持下，FGF8可诱导人表皮干细胞向成釉质细胞分化，证实人表皮干细胞可作为牙齿再生实验的上皮源性干细胞的来源，但是诱导效率不高。本项目在原有基础上期望进一步提高诱导人表皮干细胞向成釉质细胞分化的效率，同时探讨其成釉质细胞分化的分子调控机制。实验研究内容包括：（1）在人表皮干细胞培养体系中，增强FGF8诱导作用和上调Wnt/β-catenin信号活性，从而提高其向成釉质细胞分化的效率；（2）寻找PITX2下游靶基因，探讨组织工程牙齿的成釉质细胞分化的机制。研究结果将为解决人表皮干细胞作为人类牙齿再生工程的上皮源性干细胞的来源问题提供更多数据。

人表皮干细胞可作为人类牙齿再生工程的上皮源性成体干细胞的来源，但是其向成釉质细胞分化的效率不高。本项目旨在提高诱导人表皮干细胞向成釉质细胞分化的效率，同时探讨其成釉质细胞分化的分子调控机制。实验研究内容包括：（1）在人表皮干细胞培养体系中，通过添加FGF8生长因子或者过表达FGF8基因，从而增强FGF8的诱导作用。成牙率提高至45.50%和37.50%，成釉率均提高至100%。（2）在人表皮干细胞培养体系中，同时增强FGF8和SHH的诱导作用，使成牙率分别最高提高至69.20%，成釉率提高至100%。（3）CHIR-99021可提高人表皮干细胞的Wnt/β-catenin信号活性，与小鼠牙胚间充质构成的嵌合体的成牙率仅为18.20%，其中成釉率高达100%；而CHIR-99021与FGF8协同作用，则进一步提高嵌合体的成牙率至40.00%；（4）观察人表皮干细胞向成釉细胞分化的发育过程，结果发现在肾囊膜下培养的嵌合体牙胚与与正常牙胚发育一样，经历了上皮的聚集、下陷，间充质的聚集，牙本质和牙釉质的分泌的过程。嵌合体牙胚在30天内完成了牙釉质的分泌，之后嵌合体牙胚的成釉细胞凋亡；（5）探讨组织工程牙齿的成釉质细胞分化的机制，研究结果表明，SP6可能是嵌合体牙齿成釉与否的关键转录因子；同时CHIR-99021可通过上调Wnt/β-catenin信号活性水平，同时促进FGF8表达，与FGF8协同，高效诱导人表皮干细胞分化为具有分泌釉质功能的成釉质细胞。研究结果对利用人表皮干细胞作为上皮来源的成体细胞应用于人类牙齿再生的研究具有重要意义。