中药松萝“松萝胺A”抗肝癌作用及其分子机制研究

Usneae Filum with heat clearing, detoxifying, and removing liver fire, has been used mainly for liver heat and toxic heat. In the preliminary study, we systematically isolated and screened ingredients with anti-hepatoma activity from Usneae Filum, and then we found a new natural usnic acid analogue, Usenamine A (UA). UA could significantly inhibit the proliferation and promote the apoptosis in human hepatoma HepG2 cells. Moreover, UA could suppress the migration ability of HepG2 cells in vitro. UA also exhibited good anti-angiogenesis activity. Furthermore, UA could significantly inhibit the tumorigenicity of human hepatoma HepG2 cells in nude mice. Additionally, UA could dramatically inhibit PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in human hepatoma HepG2 cells. Therefore, based on previous work, this project will employ two kinds of mouse models of liver cancer to evaluate UA’s efficacy in the treatment of liver cancer, and will investigate underlying mechanisms mainly from the aspects of proliferation, apoptosis, autophagy, migration and invasion, and tumor angiogenesis. In addition, this project will explore the direct targets of UA in combination with study on the regulation of signaling pathways. Our study will systematically clarify concrete mechanisms of anti-hepatoma effect of UA from the levels of molecule, cell, and animal. In conclusion, the implementation of the project will provide experimental evidence for the prevention and treatment of liver cancer based on the theory of clearing away heat and detoxification in traditional Chinese medicine and provide a scientific basis for the discovery of anti-hepatoma candidate drugs and potential targets, which has important academic value and application prospect.

松萝具有清热、解毒、清肝等功效，主治肝热、毒热等症。前期课题组系统的抗肝癌活性成分研究，发现一个新的松萝酸类似物松萝胺A能显著抑制人肝癌HepG2细胞增殖（IC50为5.99μM）、促进细胞凋亡、抑制细胞体外迁移，并表现出较好的抗血管形成活性。体内活性试验显示其能显著抑制HepG2细胞的体内成瘤（抑瘤率53.44%）。初步机制分析发现其能够明显抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路。基于以上工作基础，本项目拟在采用两种小鼠肝癌模型进一步评价其抗肝癌作用基础上，重点从增殖、凋亡、自噬、迁移侵袭及肿瘤血管形成等方面开展作用机制研究，制备松萝胺A分子探针，探究其直接作用靶点，结合信号通路研究，从分子、细胞和动物三个层面深入阐明其抗肝癌作用的直接作用靶点和分子机制。项目的实施，将为中医基于清热解毒理论防治肝癌提供实验依据，也为抗肝癌候选药物和潜在靶点发现提供科学依据，具有重要学术价值和应用前景。

松萝胺A是前期课题组从松萝中发现的一个松萝酸类似物。本项目从体内外两方面开展了松萝胺A的抗肝癌活性评价研究，并运用多种实验方法手段，研究了其通过下调ID1蛋白水平发挥抗肝癌作用的分子机制。此外，借助靶点“钩钓”技术，探究了松萝胺A通过直接结合Myosin-9发挥抑制人肝癌细胞增殖和迁移侵袭能力的机制。我们还采用多种实验方法手段研究了其对PLK1蛋白表达以及自噬的影响，以及PLK1-自噬轴在松萝胺A抑制人肝癌细胞生长中的作用。此外，我们还探究了松萝胺A的抗血管形成活性及其分子机制。通过本项目研究我们发现松萝胺A可以抑制人肝癌细胞的增殖和迁移侵袭能力，而且能够抑制人肝癌细胞裸鼠异种移植瘤的生长。松萝胺A能够明显抑制人肝癌细胞中ID1的mRNA水平和蛋白水平。松萝胺A可以明显抑制人肝癌细胞中STAT3的活性，而且在人肝癌细胞中STAT3可以正向调控ID1的蛋白水平。此外，在人肝癌细胞中STAT3能够调控ID1的转录。AKT/mTOR信号参与了松萝胺A对STAT3/ID1信号级联通路的抑制作用。松萝胺A能够促进人肝癌细胞中ID1蛋白发生泛素化降解。STAT3和ID1参与了松萝胺A对人肝癌细胞增殖和迁移侵袭能力的抑制作用。此外，我们发现Myosin-9是松萝胺A的一个直接作用靶点。松萝胺A与Myosin-9的actin结合域具有强相互作用。松萝胺A通过抑制Myosin-9与actin的结合从而破坏了细胞骨架的结构。敲低Myosin-9的表达能够削弱其对人肝癌细胞增殖和迁移侵袭能力的抑制作用。此外，松萝胺A能够抑制人肝癌细胞PLK1蛋白的表达。进一步研究发现PLK1参与了其对人肝癌细胞增殖的抑制和凋亡的诱导作用。松萝胺A能够诱导人肝癌细胞发生自噬性细胞死亡，在人肝癌细胞中松萝胺A能够通过抑制PLK1激活自噬。松萝胺A具有较好的抗血管形成活性，可能与其能够抑制人脐静脉血管内皮HUVEC细胞中VEGF的表达以及NF-κB的活化有关。本项目研究工作能够为肝癌防治药物的发现提供先导结构或候选药物，能够为松萝胺A将来的临床应用奠定坚实的理论基础，对于长松萝的科学开发利用与新药研发也起到积极的推动作用，对于丰富中药在抗肿瘤新药开发中的应用具有重要意义。