大豆[Rag6]_P203基因介导排趋性抗蚜形成的作用机理

It is an effective way to control aphids by identifying and utilizing resistance genes. Previous studies have found that a map-based cloning gene, [Rag6]_P203, involved with antixenosis resistance to aphids by soybean transformation, was predicted to encode an E3 ubiquitin ligase. Based on these results, the gene function was confirmed by overexpression of [Rag6]_P203 in aphid-susceptible soybean varieties and utilizing RNA interference method. The E3 ubiquitin ligase bioactivity of [Rag6]_P203 was detected in vitro by recombinant expression protein in Escherichia coli, and its mutant proteins, lacking LRR sequences, transmembrane and C-terminal domain respectively, were constructed to clarify catalysis function. In order to analyze signal-transduction pathway of [Rag6]_P203, the interacted proteins were identified by the yeast two-hybrid library, and quantitative real-time PCR was used to detect the expression of marker genes of salicylic acid, jasmonic acid, ethylene and other pathways in different time of aphid-infested P203 and transgenic lines respectively before and after treatments. The cDNA library and secretory proteins, originated from the salivary glands of soybean aphids, were analyzed to screen the effectors that would elicit the response of [Rag6]_P203 against the aphids. The results provide a theoretical basis for soybean aphid-resistant breeding.

发掘与利用抗蚜基因，是防治大豆蚜虫的有效途径。前期研究通过图位克隆出候选抗蚜基因[Rag6]_P203，转基因大豆研究初步证实具有排趋性抗蚜功能，预测其编码的蛋白具有E3泛素连接酶作用。本项目以此为基础，通过[Rag6]_P203基因转化感蚜材料以及RNAi的方法来明确其抗蚜功能；采用大肠杆菌重组表达[Rag6]_P203蛋白，体外检测其E3泛素连接酶的活性，分别构建类LRR、转膜、C端结构域缺失的[Rag6]_P203突变蛋白，分析其催化功能；利用酵母双杂交文库筛选与[Rag6]_P203互作的蛋白，定量PCR检测P203、转化材料感蚜前后不同时间内水杨酸、茉莉酸、乙烯等信号途径标志性基因的表达，解析[Rag6]_P203基因信号传导依赖的途径；对大豆蚜虫唾液腺cDNA文库与分泌蛋白进行解析，筛选诱导[Rag6]_P203基因产生抗蚜作用的效应因子。研究结果为大豆抗蚜育种提供理论依据。

将[Rag6]_P203基因转化感蚜材料‘天隆一号’，PCR鉴定出阳性转化株，除草剂筛选加代，定量PCR 检测T4代 [Rag6]_P203基因的表达，采用选择性试验和非选择性试验两种方法接蚜虫鉴定转基因植株的抗性表现，发现转化株抗蚜水平显著提高，但未完全恢复到P203的抗性。运用CRISPR-Cas9技术，敲除大豆近等基因系NIL02中的[Rag6]_P203基因，接蚜虫鉴定突变株的抗性表现，发现敲除[Rag6]_P203基因的突变体仍然存在一定的抗性。用大肠杆菌BL21分别表达重组蛋白[Rag6]_P203-MBP、[Rag6]_P203∆LRR-MBP、[Rag6]_P203∆CCD-MBP，分离纯化出重组蛋白，利用体外泛素化实验体系，检测重组蛋白的泛素连接酶活性，结果表明[Rag6]_P203具有E3酶活性。提取V1期大豆幼苗接蚜七天后的RNA，反转录成cDNA，通过酵母双杂交，筛选到与[Rag6]_P203互作的阳性克隆15个。运用转录组测序技术，从整个基因组水平上分析不同类型的抗蚜材料在接蚜前后基因表达水平的变化。研究表明，接蚜前后基因表达具有高度的相关性，抗生性抗蚜材料P746基因即时应答最快，排趋性抗蚜材料P203应答速度次之，感蚜材料‘东农47’即时应答最慢；[Rag6]_P203基因引起的大豆排趋性抗蚜与茉莉酸信号传导途径密切相关；胼胝质在P203排趋行抗蚜中起重要作用，活性氧与大豆抗蚜关系不密切。提取P203接蚜0 d、3 d和6 d蚜虫的唾液腺RNA，构建cDNA文库，酵母双杂交筛选激发[Rag6]_P203的效应蛋白。利用农杆菌介导的烟草瞬时表达系统，液相色谱-串联质谱和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析，确定19个基因作为研究重点。发表基金标注的学术论文3篇，包括IF大于3.0的SCI论文2篇，中文核心期刊1篇；培养硕士研究生2名。