Rpf结构域突变体的功能及其对MTB休眠菌复苏的影响

结核分枝杆菌（MTB）可分泌5种促休眠菌复苏的蛋白-Rpf样蛋白，该类蛋白诱导产生的抗体能抑制MTB的生长，有望用于MTB的免疫治疗，但必须去除其复苏休眠菌的功能。由于5种Rpf样蛋白在功能上有一定的重叠，剔除单个编码基因并不影响MTB的生长，而Rpf结构域具有与Rpf样蛋白相似的功能，因此本研究在已获得多种Rpf结构域突变体的基础上，拟利用MTB体外休眠菌模型筛选出对休眠菌无复苏作用，但其相应抗体能特异性封闭5种Rpf样蛋白的突变体，有效抑制MTB的生长和休眠菌的复苏；观察该突变体的酶活性变化和抗体亲合力；研究突变体在小鼠体内诱导产生的免疫应答和保护力；通过小鼠MTB急性感染模型、持续性感染模型和潜伏感染模型，明确突变体对体内MTB的生长和休眠菌复苏的抑制作用；探索该突变体对休眠相关基因表达水平的影响，为利用Rpf结构域突变体治疗MTB休眠菌持续性感染提供理论和实验依据。

完成了合同书中规定的研究内容，具体包括：表达纯化了结核分枝杆菌中5种Rpf样蛋白以及Rpf结构域(Rpfd)和三种突变体蛋白Rpfd1、Rpfd2和Rpfd3；明确了Rpf结构域及其突变体对耻垢分枝杆菌和临床痰标本中MTB促生长作用；先后制备了MTB潜伏感染细胞模型和小鼠模型；明确了Rpf结构域及其突变体的溶酶体活性和细胞壁裂解活性；Rpfd1、Rpfd2和Rpfd3分别免疫小鼠后诱导产生的抗体水平均高于Rpfd免疫组，其中 Rpfd2 产生的抗体水平最高；免疫小鼠后1w， Rpfd、Rpfd1和Rpfd2免疫小鼠诱生的IFN-γ和IL-2水平均高于生理盐水对照组；Rpfd及其突变体对MTB感染的保护力为Rpfd2 > Rpfd ( Rpfd1) > Rpfd3。Rpfd、Rpfd1和Rpfd2免疫组小鼠肺部病理变化明显轻于生理盐水对照和Rpfd3免疫组，其病理变化程度与BCG免疫组无明显差异。MTB感染小鼠在治疗后11w和13w，Rpfd、Rpfd1、Rpfd2治疗组肺部荷菌量明显少于Rpfd3治疗组和生理盐水组（P<0.05），但其对肺部MTB的控制没有达到INH+RFP联合治疗组的效果。Rpfd、Rpfd1、Rpfd2治疗组肺部肺泡壁增厚程度、肺脏实变程度及淋巴细胞浸润程度均轻于对照组，Rpfd2有望用于TB的免疫治疗。项目共计发表SCI论文6篇，中文核心期刊论文9篇，培养硕士研究生3名，获得国家发明专利2项。