基于复苏促进因子（Rpf）VBNC放线菌的可培养化研究

The culturability research of viable but non culturable (VBNC) state bacteria is the concern new hot spot for the biodiversity resources and phylogenetic studies. The resuscitation promoting factor (Rpf) of Micrococcus luteus plays a key regulatory role in the recovery of their own and its closely related some VBNC actinobacteria. In this application project, bacteria species diversity in Xinjiang desert region will be investigated for the research background, using the "Rpf recovery culture method" to activate and obtain VBNC actinobacteria. In the meantime, both the conventional and culture-independent approach are used to obtain the general culturable and unculturable actinomycetes species, and to verificate and validate the Rpf effective thresholds. Based on 16S rRNA gene sequences, the VBNC actinobacteria phylogenetic tree of homologous relationships will be built. Expectations initially clear the amount of information of the VBNC actinomycetes species, and the molecular biological characteristics of the Rpf recovery. In addition, the initially clear the composition of the VBNC actinobacteria flora, and the molecular mechanisms of the Rpf recovery. The results of this study reveal the species diversity in special ecological environment of Xinjiang region, for which improving to obtain the VBNC actinomycetes resource, increase its isolation abundance, approach pathways, database capacity of the regional microbial resources, have the important significance. At same time, also for the development and utilization of the VBNC bacteria resources in a variety of other ecological environment provide important theoretical basis.

环境中占总量90%以上未知微生物处于活的非可培养（VBNC）状态，因而复苏可培养化是微生物学及其资源开发利用关注的重要课题。本申请项目针对放线菌多样性资源丰富的新疆等特殊生态环境，利用复苏促进因子（Rpf）复苏培养法调控 VBNC放线菌的复苏可培养化；采用MPN最大或然数法、传统分离法和分子生物学的免培养法比照验证VBNC菌群的存在实态，确证VBNC菌体的可培养化与Rpf复苏有效阈值，获取传统方法难以获得的VBNC放线菌菌种资源；扩增16S rRNA基因与克隆文库构建可培养化VBNC放线菌系统关系树，阐明VBNC物种多样性。本研究结果对提高获取放线菌资源丰度与可资源化途径具有重要意义，可为解析多种生态环境中VBNC微生物存在实态、认知物种多样性组成以及资源的开发利用等提供新的研究思路和方法。同时可为促进我国在工农业、环保和医学等领域VBNC放线菌资源的开发利用提供重要的理论依据。

环境中只有0.01-10% 的微生物能用传统方法培养，绝大部分未知微生物处于活的非可培养VBNC状态，表明巨大的微生物资源尚不为人们所知，极大地限制了微生物学所涉及的所有领域对微生物定性定量的正确把握与有效利用，因而复苏可培养化的创新技术研发是微生物学面临亟待解决的课题。. 本研究以新疆沙漠区域土壤为研究对象，探索利用藤黄微球菌分泌产生的复苏促进因子Rpf调控土壤中处于VBNC状态的放线菌。由合作单位中国科学院微生物研究所提供新疆沙漠土壤样品20份，分别添加含Rpf的培养基作为处理组，以不含Rpf的为对照组，经MPN培养系培养计数MPN值，求得单位土壤样品中处理组和对照组的细菌总量，明确Rpf的复苏促进效果。同时以DGGE-PCR分子生物学手段，采用16S rRNA基因扩增、测序构建系统关系树，明确土壤样品中对Rpf敏感的VBNC物种多样性，获取更多未知的微生物资源与分子信息。. 研究结果显示：新疆沙漠土壤中存在多种放线菌与细菌资源，20个样品中分离到17个属的60个菌株，达新种水平的有14菌株，其中2个新种放线菌已鉴定发表，33个经Rpf复苏而来的VBNC菌株被国际基因库DDBJ首次收录公布。其次，对照组中检出2.4x102-1.1x106个细胞·g-1，而添加Rpf处理组可分离到2.4x102-4.6x106个细胞·g-1，分离丰度提高1 - 49.5倍，表明Rpf对土壤中处于VBNC状态放线菌（细菌）的复苏促进生长调控作用。第三，利用DGGE-PCR分子生物学方法证实添加RpF的处理组中比对照组有较多的指纹条带，检出了经Rpf复苏生长调控后成为可培养化的种群。. 本研究证实了放线菌纲藤黄微球菌所分泌的Rpf信号蛋白对近缘高GC革兰氏阳性放线菌、部分低GC革兰氏阳性以及革兰氏阴性细菌的复苏促进生长作用，确立了一种能促进VBNC细菌生长并提高分离丰度的创新方法与应用技术，为解析多种生态环境中VBNC微生物存在状况、认知微生物资源多样性组成等提供新的研究思路和方法。同时为促进我国在工农业、食品安全、环保和医学等领域VBNC细菌资源的研发利用提供重要的科学依据。