利用噬菌体构建Rpf表达系统复苏并清除体内结核休眠菌研究

The most crucial reason causes the course of TB Chemotherapy so long is the dormant state of M.tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis), and with occasionally reproduction. If all the dormant M.tuberculosis could be resuscitated and eliminated completely, the course of TB chemotherapy can be expected to be shortened significantly [Shuliang Guo, et al. Medical Hypothesis,6 Feb, 2015]. Currently, Recovery-promoting factor (Rpf) could induce the dormant M.tuberculosis to be resuscitated in vitro study, but the targeted delivery for Rpf to the infected area of dormant M.tuberculosis couldn’t be realized yet, which become the bottleneck for the study of Rpf resuscitation in vivo. In order to solve this problem, our study intends to use the characteristic of mycobacteriophage-TM4 which could target-infect the dormant M.tuberculosis to build a new TM4-Rpf expression system. In our study, we intend to study the expression of Rpf and the ability for Rpf to resuscitate the dormant M.tuberculosis in vitro. By the infection of Mycobacterium smegmatis (MS), the MS-TM4-Rpf infectosome could be got to study the ability of the protectively delivering TM4-Rpf expression system by MS aerosol inhalation into alveoli macrophages. We also study the ability of TM4-Rpf expression system with displayed Rpf to identify, resuscitate, and eliminate all the dormant M.tuberculosis together with chemotherapy in macrophages. Our work very probably lay the foundation for the study resuscitation for dormant M.tuberculosis in vivo and get breakthrough applicability achievements.

结核菌转入休眠并偶尔繁殖是化疗疗程长的关键原因。将休眠菌集中复苏并清除有可能显著缩短化疗疗程[Guo Shuliang,et al.Medical Hypothesis,6 Feb，2015]。复苏促进因子（Rpf）在体外能促进结核休眠菌复苏，但无法向体内结核休眠菌潜伏区有效递送Rpf成为目前制约体内休眠菌复苏研究的瓶颈。为解决这一难题，本课题拟利用分支杆菌噬菌体TM4能靶向感染结核休眠菌的特性，构建全新的TM4-Rpf表达系统，研究其表达、展示Rpf并在体外复苏结核休眠菌的能力；然后通过感染耻垢分支杆菌（MS），获得MS-TM4-Rpf 感染体，研究MS经气溶胶吸入形式向体内巨噬细胞（Mф）内保护性转运TM4-Rpf表达系统的能力；研究表面展示有Rpf的TM4-Rpf表达系统在Mф内主动识别、复苏并与化疗结合清除结核休眠菌的能力。课题有望为体内复苏研究奠定基础并获得突破性应用研究成果。

本课题拟利用分支杆菌噬菌体TM4能靶向感染结核休眠菌的特性，构建全新的TM4-Rpf表达系统，研究其表达、展示Rpf并在体外复苏结核休眠菌的能力；然后通过感染耻垢分支杆菌，获得MS-TM4-Rpf 感染体，研究MS经气溶胶吸入形式向体内巨噬细胞内保护性转运TM4-Rpf表达系统的能力；研究表面展示有Rpf的TM4-Rpf表达系统在Mф内主动识别、复苏并与化疗结合清除结核休眠菌的能力。虽然我们成功构建了TM4-RpfE的重组噬菌体，但是在进一步研究中我们发现由于所构建的重组噬菌体是与野生型的TM4混合存在的，传代次数越多，含重组噬菌体变少以致最后消失。目前考虑是重组噬菌体的不稳定性导致了传代过程中的丢失。尽管我们遇到了这样的问题，无法完成预定的研究目标。课题组仍然在失败的过程中寻找其他的可能解决目前严峻结核的防控问题，后续对Guo1噬菌体裂解酶和CRISPR-Cas1蛋白在结核分枝杆菌噬菌体抵抗和耐药中的作用和机制进行了研究：Guo1-lysin蛋白对分枝杆菌（包括耻垢分枝杆菌、结核分枝杆菌）具有良好的抗菌活性；Cas1基因参与分枝杆菌生长调节，可能与分枝杆菌致病性密切相关。Cas1蛋白过表达提高了利福平、左氧氟沙星和乙胺丁醇的致死活性，Cas1过表达显着降低了药物诱导的滞留菌，从而增加结核分枝杆菌对一些抗生素的敏感性。同时对研究方向进行了转化，在结核的诊断方向进行了积极探索：首次利用基于富勒烯的新型碳纳米复合物（NGS-C60-AuNPs, C60-N-CNTs/GO) 作为信号放大和产生的信号标签，及改良的导电有机金属框架（P-MOF）用于提高探针固定效率，构建了两种灵敏的电化学传感检测平台，分别对结核分枝杆菌DNA IS6110片段及特异性抗原MPT64进行实时定量检测，并将构成的平台用于临床实践中，取得了令人满意的结果。本课题组的研究结果同样为将来进一步缩短结核病化疗疗程奠定了实验基础，同时为结核病的早期快速诊断提供了新的技术平台。