蓖麻蚕核型多角体病毒CTL-1抑制酚氧化酶活性及其作用机理

Conotoxin-like peptide (CTL) from baculovirus has some homology with conotoxin from Conus. No experimental evidence of similar function between these two peptides was observed. We found CTL shares higher homology with phenoloxidase inhibitors (POI) from insects with same disulfide backbone. And the POI activity of SacyCTL-1 was confirmed at first time in our recent study. This result suggested that baculoviral CTL might regulate the immune system of host, which might contribute to the progress of pathogenesis. In further study, the inhibition efficiency and dynamics of SacyCTL-1 to phenoloxidase (PO) will be analyzed, and the mechanism will be revealed by site-directed mutagenesis and nuclear magnetic resonance (NMR) technology. The effects of SacyCTL-1 on baculoviral infection and proliferation in Samia cynthia laeve will be analyzed. The changes of PO activity in hemolymph and melanization of infected cells will be detected. Through these studies, the regulation pattern of pro-PO activation system by SacyCTL-1 will be revealed. These results will light a novel sight on the interaction between baculovirus and host and will provide a theoretical basis for application of baculoviral ctl gene.

杆状病毒芋螺毒素类似多肽（CTL）与芋螺毒素具有较高相似性，但已有研究并不能证实两者间有类似功能。本课题组发现杆状病毒CTL与昆虫内源性酚氧化酶抑制剂（POI）有着更高的序列相似性及相同的二硫键骨架，并证实蓖麻蚕核型多角体病毒（SacyNPV） CTL-1具有酚氧化酶抑制活性，可能参与杆状病毒对宿主免疫系统的调控，从而有利于病毒的感染进程。为证实这一推测，本课题拟借助离体实验,研究SacyCTL-1对酚氧化酶的抑制效率和抑制动力学，并利用基因定点突变、核磁共振等技术揭示其抑制机理；进一步通过活体实验,分析SacyCTL-1对病毒感染和增殖的影响，检测病虫血液中酚氧化酶活性及受感染细胞的黑化反应程度的变化，揭示SacyCTL-1对宿主酚氧化酶原激活系统的调控及其病毒学意义。本课题将有利于我们从新的角度理解和揭示杆状病毒与宿主之间的相互作用方式。

杆状病毒芋螺毒素类似多肽（CTL）与芋螺毒素具有较高相似性，但已有研究并不能证实两者间有类似功能。本项目利用原核表达系统及小鼠醋酸扭体实验证实，蓖麻蚕核型多角体病毒（SacyNPV）CTL-1和AcMNPV CTL都没有镇痛活性。本项目对杆状病毒CTL进行进化和分类研究，发现其可以分为Ⅰ型CTL和Ⅱ型CTL，两者在理化性质上存在显著差异。其中，包括SacyCTL-1在内的Ⅰ型CTL与昆虫内源性酚氧化酶抑制剂（POI）有着更高的序列相似性及相同的二硫键骨架，且具有POI活性相关的酪氨酸残基。qRT-PCR分析表明，SacyNPV ctl-1为晚期表达基因（24 hpi），亚细胞定位分析表明，SacyCTL-1定位于细胞膜，为分泌型蛋白。分别将SacyNPV ctl-1基因及消除了酪氨酸对应密码子的突变基因ctl-1M导入不含ctl基因的家蚕核型多角体病毒（BmNPV），含野生型基因的病毒感染家蚕可阻止血液黑化，而基因突变后，不能阻止血液黑化，表明SacyCTL-1具有酚氧化酶抑制活性,且酪氨酸残基对其抑制活性至关重要。但是，从大肠杆菌表达系统和离体家蚕细胞中表达的SacyCTL-1并没有酚氧化酶抑制活性，这可能与两者不能对表达的SacyCTL-1进行多巴化修饰有关。本研究的结果有助于从酚氧化酶水平理解杆状病毒与宿主之间的相互作用。生物信息学分析发现，大量knottin成员与SacyCTL-1、ω-MⅦA具有相同的二硫键骨架，尽管SacyCTL-1没有镇痛活性，但是本项目证实3种代表性的SacyCTL-1/ω-MⅦA多肽具有显著的镇痛活性，包括武靴藤甜味抑制剂（GsGUR）、美洲商陆抗菌肽（PaAMP1）、家蝇酚氧化酶抑制剂（MdPOI），这为镇痛多肽的发掘提供了新的思路，也预示着可能利用资源丰富的植物和昆虫生产镇痛多肽。