胆固醇介导家蚕核型多角体病毒入侵机制研究

Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV) is the most severe baculovirus pathogen in sericultural industry, which caused about 15% loss of the total sericultural output value, and no treatment methods are currently available. Previous research showed that BmNPV entry into BmN cells depend on the cholesterol of the membrane in dose-dependent manner, the mechanism, however, need further investigation. In this study, the interaction between virus and host will be studied by quantum dot-labeled BmNPV. Firstly, the binding activity of cholesterol recognition amino acid consensus(CRAC) in GP64 will be clarified by recombinant viruses infectivity which possess point-mutant on the key amino acid of CRAC sequence. Secondly, exploring and optimizing the label condition and trafficking parameter on baculovirus which contained GP64 label by quantum dot and eGFP fused to VP39. Lastly, we will conduct the interaction analysis between virus and host cell. To confirm the role of cholesterol plays in the binding and internalization, the fluorescence intensity or percentage of the cells treated with/without different dose chemical were recorded by laser confocal microscope and flow cytometer. And to confirm whether cholesterol was involved in the subsequent membrane fusion, we will study the con-localization and separation of double fluorescence in vivo and in vitro. Therefore, the role of cholesterol plays in the infection will be illuminated, which will lay the foundation for the treatment research of BmNPV and baculovirus application and modification.

BmNPV是蚕业生产中危害最严重的杆状病毒，其引起的损失约占蚕桑总产值的15%，目前为止尚无有效的治疗措施可以利用。我们的前期研究发现BmNPV入侵宿主细胞依赖于细胞膜上胆固醇，但具体作用机制尚不清楚，本研究将利用量子点示踪技术开展BmNPV与宿主之间的互作研究。首先确定病毒的胆固醇结合活性，对融合蛋白GP64中胆固醇识别序列进行点突变，通过突变病毒感染性的变化，确定有结合活性的胆固醇识别序列。其次探索病毒量子点标记条件、优化激光共聚焦显微镜示踪参数。最后开展病毒与宿主互作研究，确定胆固醇在病毒吸附等过程中的作用；利用激光共聚焦显微镜、流式细胞仪定性、定量分析标记病毒在不同剂量药物处理细胞中吸附、内化过程，并通过体内以及体外膜融合过程中荧光共定位及分离情况，明确胆固醇是否也参与膜融合，从而阐明胆固醇介导病毒入侵机制，为BmNPV防治研究及杆状病毒应用改良提供基础。

BmNPV是蚕桑生产中危害最严重的病原微生物，虽然其基因组与AcMNPV高度相似，但宿主域迥异，其致病机理仍不清楚。我们前期研究发现BmNPV的BV采用巨胞饮内吞方式进入家蚕细胞，而且胆固醇是BmNPV入侵所必需的细胞因子，本项目以BmNPV中关键的膜融合蛋白GP64为研究对象，对GP64信号肽、CRAC及内吞方面开展分析，阐明胆固醇介导BmNPV入侵机制研究。通过4年的努力，我们全面完成了原计划目标，在以下几方面取得了重要的原创性研究成果：1）确定BmNPV病毒粒子中GP64信号肽没有被切除。这种不切割有严格的宿主域特异性，信号肽在非宿主体内被切割；GP64通过信号肽n区形成的较长α螺旋阻止信号肽酶切割，而且由这个未切割的α螺旋介导GP64分泌。2）从病毒方面揭示BmNPV入侵依赖胆固醇机制。确定GP64中CRAC1与CRAC2是BmNPV感染必需基序，其中CRAC2介导病毒的膜融合，而CRAC3突变会延长感染幼虫死亡时间。3）从宿主层面揭示细胞膜胆固醇介导BmNPV入侵机制。细胞膜上胆固醇可以激活细胞巨胞饮内吞作用，这是BmNPV跨越细胞核膜屏障的关键；直接膜融合导致核衣壳不能被转到宿主细胞核内；而巨胞饮内吞方式还可介导BmNPV在非宿主细胞中感染扩增。此外，还对相关领域进行了拓展研究，包括信号肽存在改变GP64高级结构，BmNPV的BV在细胞内包膜的新机制，以及胆固醇在增加外源蛋白表达量中应用等。上述研究成果为全面揭示杆状病毒入侵的分子机制及宿主域奠定了重要研究基础，也为改良杆状病毒表达系统改良提供信息。截止目前为止，共发表项目标注的SCI论文5篇，培养硕士研究生5名，并获得硕士学位。