法尼酯X受体调控visfatin表达在糖尿病肾病发病中的作用及机制研究

Both FXR and visfatin are expressed in kidney,and both of them are associated with diabetic nephropathy.However, so far it is not clear whether FXR can regulate visfatin expression. Through in silico analysis with a Web-based algorithm, we found there was one sequence of DNA in the visfatin's gene promotor which would be full matched with the classical sequence of FXR;and we also found activated FXR can inhibit the expression of visfatin in glomerular mesangial cells. To ascertain the molecular mechanism that FXR regulate visfatin expression and the influence on the diabetic nephropathy, we shall use correlative techniques including Luc report genes, electrophoretic mobility shift assay(EMSA),super EMSA and chromatin immunoprecipitation(ChIP)to determine the precise FXR's negative combining element in gene promoter of visfatin and clarify the molecular mechanism about down-regulation of visfatin expression by FXR.Then by the reseach in vitro including cell proliferation assay,activity analysis of TGF-β1/Smad,activity assay for NFκB, visfatin gene slilencing by siRNA and observing down-regulation of visfatin by FXR in db/db mice,we shall declare the biological significance of FXR-visfatin regulative pathway in DN.This research may provide new scientific evidence for elucidating the relationship between FXR and DN.

法尼酯X受体（FXR,一种重要的核受体）和visfatin均以较高水平表达于肾脏，且都与糖尿病肾病（DN）密切相关；但visfatin是否受FXR调节目前尚不清楚。本项目组利用生物信息学分析显示visfatin基因启动子区含有能与FXR结合的经典序列；并发现激活FXR可抑制肾小球系膜细胞visfatin表达。在此基础上，拟借助报告基因检测、EMSA、Super EMSA、染色质免疫沉淀等技术，鉴定visfatin基因启动子区FXR的负性结合位点，明确visfatin是FXR的一个新靶基因，阐明FXR抑制该基因表达的分子机制；经细胞增殖实验、TGFβ1/Smad通路活化分析、NFκB活性检测、SiRNA使visfatin基因沉默等体外实验以及在DN小鼠体内观察FXR对visfatin的调节，初步揭示FXR下调靶基因表达在DN中的生物学意义，为深入阐明FXR和DN之间的关系提供新的科学依据。

糖尿病肾病是糖尿病最为严重的并发症之一，目前DN的发病机制尚未明确，更缺乏有效的防治手段。肾小球系膜病变是DN最为突出的早期病理表现，系膜细胞增殖、系膜区扩张、细胞外基质异常沉积、局部炎症细胞浸润，以及由此导致的肾小球硬化是DN进展的关键环节。本研究旨在阐明FXR调控visfatin表达的分子机制及其在糖尿病肾病发病过程中的作用。首先我们检测FXR在不同肾脏固有细胞均有表达，高糖刺激下肾小球系膜细胞visfatin表达显著升高，给予FXR激动剂GW4064后能够有效抑制visfatin表达；我们研究发现激活FXR抑制visfatin表达对系膜细胞的炎症因子表达起到显著抑制作用，高糖条件下系膜细胞p-p65、MCP-1表达显著下降，IκBα明显增加；激活FXR抑制visfatin表达显著抑制高糖诱导系膜细胞TGF-β/Smad通路及促纤维化因子Collagen IV，FN 和 α-SMA的表达；同时，我们研究发现激活FXR抑制visfatin表达对系膜细胞增殖及先关基因PCNA表达起到显著抑制作用。为探讨FXR和visfatin调控关系，通过生物信息学预测在visfatin基因上游启动子区存在FXR可能结合位点，构建启动子全长及截短的荧光素酶报告基因质粒，结果提示FXR通过结合visfatin启动子对其转录调控，结合位点可能位于启动子区域-1607bp~-1192bp。在体实验部分，我们运用 db/db小鼠作为糖尿病肾病动物模型，给予FXR激动剂GW4064处理能够降低糖尿病肾病小鼠的尿蛋白、血肌酐和尿素氮水平，延缓糖尿病肾病进展，形态学染色提示系膜增生和细胞外基质明显减轻，同时，免疫组化及Western blot提示visfatin、炎症相关基因及促纤维化因子表达也明显较糖尿病肾病组下降。综上所述，本研究提示激活FXR抑制visfatin表达能够抑制系膜细胞增殖、炎症及纤维化因子的表达，延缓糖尿病肾病的进展。利用本课题经费的支持，已培养博士研究生一名（在读）。本研究的部分结果已发表在《Mol Cell Endocrinol》，另一部分研究结果正在总结成文。