基于"荧光开关"灵敏性可视化分离与"标签分子"质谱检测增敏的体内多肽类药物分析新方法的研究

Protein polypeptide drugs have become a hotspot in the field of biomedical research in the world. But due to its special physical, chemical properties, complex pharmacokinetic changes in the body and the limitations of existing analysis method, the accurate and reliable analysis detection method have been made for protein polypeptide drugs become a big difficulty. On the basis previous research of fluorescent probes and polypeptide drugs, the project will combine nanoparticles, fluorescence technology and LC - MS bioanalysis technology in vivo to synthesis and modify the double function of quantum dots (QDs) nano fluorescent probe with "recognized molecule" and "molecular tag" for target peptide. Based on the theory of fluorescence resonance energy transfer (FRET), we use small molecular fluorescent dyes and QDs to build FRET “fluorescent switch". With fluorescent "switch" sensitivity "quantitative" monitoring target peptide the process of separation, purification and enrichment, enhance the high sensitivity and strong specificity of peptide analysis detection by LC-MS. In this project, we try to explore new method of "based on sensitivity fluorescence switch visually separation and molecular tag enhance LC-MS biopharmaceutical analysis sensitivity of polypeptide drugs ". It will overcome the limitations of the current quantitative analysis method of polypeptide drugs, and establish high specificity or sensitivity quantitative analysis method of complex polypeptide drugs in biological matrix. Its also provides new methods and new ideas in order to promote the development of protein polypeptide drugs and its clinical application research.

蛋白多肽类药物目前已成为全球生物医药研究领域的一大热点，然而其特殊的理化性质和复杂的体内药代动力学变化，以及现存分析方法的局限性，使建立准确可靠的蛋白多肽类药物的分析检测方法成为一大难点。本项目拟在前期荧光探针及多肽类药物研究的基础上，结合纳米粒子、荧光技术及LC-MS体内分析技术，通过“识别分子”与“标签分子”制备双功能量子点 (QDs)荧光探针，基于荧光共振能量转移理论(FRET)，选用小分子荧光染料与上述QDs构建 “荧光开关”；凭借“荧光开关”灵敏性“可视化”监测目标多肽的分离、纯化与富集过程，最终实现LC-MS对目标多肽分析检测的高灵敏度及强专属性，力求探索一种“基于荧光开关灵敏性可视化分离与标签分子质谱检测增敏的体内多肽类药物分析”的新方法，建立复杂生物基质中多肽类药物的高特异性、 高灵敏度及高专属性的定量分析方法，为推动蛋白多肽类药物的研发及其临床应用研究提供新方法和新思路。

与传统化学药物相比，蛋白多肽类药物给药剂量小、血药浓度低、结构特殊且不稳定，因而对检测方法的灵敏度和准确度要求较高。为确保药物的安全性和有效性，结合蛋白多肽类药物自身的特点，建立全面的蛋白多肽类药物分析方法和药代动力学评价体系具有非常重要的意义。本项目针对上述多肽类药物体内分析遇到的困难和现存分析方法的局限性，探索了一种“基于荧光开关灵敏性可视化分离与标签分子质谱增敏的体内蛋白多肽类药物分析”的新方法，设计了显著增强质谱响应的标签分子，基于FRET原理构建小分子染料与双功能化QDs的灵敏性“荧光开关”。“荧光开关”灵敏性“可视化”监测生物样本中多肽类药物的分离、纯化与富集过程，凭借QDs与小分子荧光探针的两条荧光信息通道共同表达，实现内部校准，干扰因素少，重复性强，定量精确且误差小，使目标多肽的分离、纯化和富集过程可以“灵敏的看得到”。利用“荧光开关”的标签分子增强质谱响应和选择离子化效率，二次提高蛋白多肽类药物质谱检测的灵敏性，从而建立了复杂生物基质中蛋白多肽类药物的高特异性、高灵敏度及高专属性的定量分析方法。顺利完成了项目计划书中的研究内容，成功解决了本项目提出的关键问题。同时，开发了一系列蛋白多肽类药物（碱性磷酸酶、凝血酶、多肽）及质谱增敏检测的体内分析技术，并应用于本课题组研发的多肽偶联小分子药物（丹参酮 ⅡA、紫杉醇、两性霉素B）的研究领域，如药代动力学参数的获取、肿瘤靶标的筛选、药物的体内分布等，为推动蛋白多肽类药物的研发及其临床应用研究提供新方法和新思路。