hCGRPα和HIF-1α基因共修饰骨髓干细胞联合自体骨移植治疗股骨头坏死的实验研究

Osteonecrosis of the femoral head(ONFH) is a high mutilational disease in orthopedics. It's too difficult to revascularize and repair the zone of ischemic and necrosis. A novel strategy to enhance bone repair is to combine angiogenic factors and osteogenic factors. We combined calcitonin gene-related peptide α(CGRPα) and hypoxia inducible factor 1α (HIF-1α) by using an internal ribosome entry site to link the genes to construct Ad-hCGRPα-IRES -HIF-1α and infect the amplified BMSCs. After necrosis bone removing , transplant the infected BMSCs combined autogenous bone to the osteonecrosis area. To observe the survival, proliferation, differentiation of transplanted BMSCs and the time, intensity, biologic activity of target gene expression and the imaging, histological change of animal model, study the effect of hCGRPαand HIF-1α co-modified BMSCs combined autogenous bone transplant to revascularize and repair the zone of ischemic and necrosis and evaluate the treatment effect to ONFH

股骨头缺血性坏死是骨科领域致残率较高的疾病。缺血坏死区的血运重建和骨组织修复非常困难。联合血管生成调节因子和成骨调节因子是促进骨修复和血运重建的新策略。将hCGRPα基因与HIF-1α 基因通过内部核糖体进入位点（IRES）连接后构建的双基因共表达腺病毒Ad-hCGRPα-IRES -HIF-1α感染扩增后的自体骨髓间充质干细胞（BMSCs）。在坏死骨刮除后，将hCGRPα和HIF-1α修饰的BMSC联合自体骨支撑移植到骨坏死区。通过观察移植的BMSC的存活、增殖、分化和目的基因表达的时间、强度、生物学活性以及动物模型的影像学、组织学表现，研究hCGRPα和HIF-1α共表达的BMSC联合自体骨移植对骨坏死区的骨组织修复和血运重建的影响，评价其对股骨头坏死的治疗效果，为股骨头坏死的早中期治疗提供新的思路和方法。

股骨头缺血坏死( osteonecrosis of the femoral head, ONFH ) 是由不同病因导致股骨头血液供应破坏而引起软骨下骨变性、坏死，继而造成股骨头塌陷，最终导致髋关节退行性破坏性改变。骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins, BMPs）在骨的发育及成熟过程中细胞生长与分化的主要调节因素，调节骨组织的形成。降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）是一种由37个氨基酸组成的生物活性多肽。正常生理状态下，骨髓处于低氧环境。HIF-1α在血管生成偶联软骨内成骨的过程中起关键的调控作用。因此，在股骨头坏死的治疗中联合应用hCGRPα和HIF-1α，同时促进血管生成及骨再生，可能会加速骨形成时间。主要研究内容：1）构建并鉴定重组腺病毒Ad-GFP, Ad- hCGRP-GFP，Ad-HIF-1-GFP和Ad- HIF-1-IRES-hCGRP-GFP；2）分离培养并鉴定兔BMSCs，检测hCGRPα和HIF-1α联合对兔BMSCs的成骨影响；3）制作家兔股骨头坏死模型，观察体内环境下的hCGRPα和HIF-1α联合对血管再建和骨形成的速度的影响；4）检测了BMP-2与HIF-1α联合对股骨头坏死区的促血管生成和促成骨能力。重要结果：1）构建并鉴定了重组腺病毒；2）同时表达hCGRPα和HIF-1α的病毒转染兔BMSCs后能促进碱性磷酸酶的活性，茜素红S染色明显增加，定量后与单独表达组比较有显著性差异。3）实时定量PCR和western blot检测成骨分化相关基因的表达， Osterix, BSP, OCN, ALP, OPN明显高于空病毒组和单独表达组。Runx2则明显高于空病毒组和HIF-1α组。5）制作家兔股骨头坏死模型后，HE染色显示联合表达组成骨能力明显增强。6）各项指标显示BMP2与HIF-1α联合对股骨头坏死区的促血管生成和促成骨能力明显增强，CD34免疫组化染色结果显示联合组的新血管平均值明显高于其他各组。本实验研究的科学意义在于不但可以在干细胞移植联合基因治疗方面为股骨头坏死的早期治疗提供新的方法，而且可利用同时转移多个协同基因的BMSCs来尝试进行骨科领域的其他疾病如大块骨缺损的治疗研究，形成新的研究方向。