基于量子点的比率荧光传感器用于活细胞中microRNA检测研究

Mature microRNAs (miRNAs) are a group of small size, non-coding RNAs that play regulating roles in many critical biological processes at transcriptional and post-transcriptional level. Some miRNAs have been classified as potential biomarkers for cancer and other diseases. Detection of abnormally expressed miRNAs in cancer cells has sparked the greatest interest in developing highly reliable, sensitive and specific analytical methods. Fluorescence method stands out to be a powerful and visual means for the single cell analysis..In the past, we have successfully developed ratiometric fluorescent sensors based on multi-colored quantum dots (QDs) for detection of trace metal ions and G-quadruplex DNA in living cells. Herein, we propose to develop dual-colored QDs/lipid and QDs/cerasome nanostructures with excellent biocompatibility, to construct ratiometric fluorescent sensors by bioconjugation, for detection of trace miRNAs in cytoplasm, in combination with signal amplification. Specifically structured capture probes are incorporated in the sensors to achieve highly specific detection of miRNAs. In combinational, high fluorescence quantum yields of QDs, ratiometric fluorescence, and signal amplification are regarded to significantly improve accuracy and sensitivity of miRNA detection. The development of this new type of sensors is of particular importance to study fundamental biological functions of miRNA as well as to develop low-cost and reliable techniques for clinical diagnostics.

成熟的微小RNA (miRNA)是一类保守的非编码单链RNA分子，在转录和后转录水平上起重要基因调控作用。许多miRNAs被证明是潜在的癌症生物标志物。活细胞内化学组分复杂，miRNA含量极微且多组分共存，因此发展可靠的、高灵敏和高特异性的miRNA分析方法成为单细胞分析中的前沿课题。在成功实现比率荧光传感器用于活细胞中离子及G-四链体DNA检测的基础上，申请者在本课题中提出组装量子点/脂质体或量子点/硅质体，构建生物相容性良好的比率荧光传感器，并集成利用信号转换和放大技术，用于活细胞内miRNA原位检测研究。利用捕获探针结构的特别设计可实现miRNA检测的特异性；量子点高荧光量子产率、比率荧光，并结合信号放大技术可实现miRNA检测的高灵敏度和准确度。这一荧光生物传感器的成功开发，无论对于研究miRNA生物学功能还是发展未来低成本的临床诊断技术都具有重要的科学意义和应用价值。

荧光传感器具有简单、灵敏的特性，提供了生物标志物如循环微小RNA（miRNA）检测的新方法。本课题基于量子点荧光团和球形核酸结构，构建了比率或多色荧光信号输出的纳米生物传感器，发展了针对细胞内miRNA的高灵敏、原位、荧光成像分析方法；构建了量子点荧光编码微球悬浮阵列，发展了针对临床样本中循环miRNA标志物的超灵敏、多元的分析方法。主要研究结果包括：（1）组装构筑了双色量子点包覆于脂质体的球形核酸荧光传感器，设计了双链特异性核酸酶辅助的靶标循环介导的信号放大机制，基于微孔板比率荧光成像实现了循环miRNA可靠性的定量检测，检测限低至1 fM。（2）可控构筑了双色量子点包覆于硅质体的球形核酸荧光传感器，设计了双靶标（APE1酶和miRNA）门控的双DNA酶步行器介导的信号放大机制，通过双通道/比率荧光成像，实现了肺癌/正常肺细胞，肝癌/正常肝细胞以及乳腺癌/正常乳腺细胞的区分，以及非小细胞肺癌细胞的精确分型。（3）可控构筑了双色量子点包覆于硅支撑脂质体的球形核酸荧光传感器，设计了三靶标键盘锁控制的DNA酶接力走介导的信号放大机制，通过双通道/比率荧光成像，实现了不同肿瘤细胞的精确区分以及乳腺癌的精确分型。（4）可控构筑了量子点胶束球形核酸包覆于水凝胶的多色荧光传感器，设计了靶标触发DNA酶步行器介导的信号放大机制和靶标富集致使的信号增强机制;通过三通道荧光共聚焦成像，实现了基于三种miRNA的非小细胞肺癌的精确分型。（5）可控构筑了量子点荧光编码微球，偶联核酸构建了悬浮阵列；设计了链式取代反应介导的信号放大机制；利用量子点编码荧光为识别信号，Ru-DI荧光为报告信号，通过比率荧光成像实现了肝癌HepG2细胞裂解液中三种miRNA标志物的检测, 检测限低至1 fM。（6）可控构筑了量子点荧光编码微球，偶联核酸构建了悬浮阵列;设计了靶标miRNA触发DNA级联回路介导的信号放大机制；利用量子点编码荧光为识别信号，标记染料荧光为报告信号，通过流式细胞术实现了非小细胞肺癌病人血清中五种循环miRNAs的精确检测, 检测限低至10 aM。综上，本课题所发展的新型纳米生物传感器/（微球）阵列以及高可靠性的比率荧光成像技术，对于推动早期分子诊断技术的发展具有重要的理论意义和应用价值。