骨髓间质干细胞旁分泌NGF诱导肝星状细胞凋亡的机制研究

诱导活化态肝星状细胞（HSC）凋亡是治疗肝纤维化的关键。大量研究证实，骨髓间质干细胞(MSC)移植可治疗肝纤维化，但其机理未明。申请人前期研究发现，MSC与HSC共培养时，MSC可旁分泌神经生长因子（NGF），同时HSC的NGF受体P75表达上调，HSC凋亡增加，提示MSC可能通过NGF诱导了HSC的凋亡。本项目拟用RNA干扰、WB、IP等技术，进一步研究①MSC旁分泌NGF对体内外活化态HSC凋亡的影响；②HSC凋亡信号通路（NGF-Akt-FOXO-CyclinD-Rb；NGF-Akt-FOXO-Bim-Cyto C-Caspase 9，3）的激活及其与HSC凋亡的关系。证实由MSC旁分泌NGF启动的上述信号通路在HSC凋亡中的关键作用。本研究旨在阐明MSC通过NGF介导的信号通路诱导HSC凋亡的分子机制，为最终揭示MSC治疗肝纤维化的机理奠定基础。

诱导活化态肝星状细胞（HSC）凋亡是治疗肝纤维化的关键。大量研究证实，骨髓间质干细胞(MSC)移植可治疗肝纤维化，但其机理未明。申请人前期研究发现，MSC与HSC共培养时，MSC可旁分泌神经生长因子（NGF），同时HSC的NGF受体P75表达上调，HSC凋亡增加，提示MSC可能通过NGF诱导了HSC的凋亡。在本研究中，本课题组构建稳定下调人NGF表达的MSC细胞株（lenti-MSC）；建立MSC/HSC、lenti-MSC/HSC、HSC、肝细胞等共培养体系。同时建立大鼠肝纤维化模型备用。我们鉴定出有效干扰人NGF表达的SiRNA序列，并且以慢病毒质粒Pll3.7作为载体，通过酶切，插入以干扰人NGF的SiRNA序列或对照siRNA为模板设计的发夹样序列，形成有效下调人NGF表达或对照组的慢病毒载体质粒，测序鉴定后包装慢病毒,分别感染人MSC，72小时后Western-blot和免疫荧光鉴定NGF表达确认干扰有效，流式分选获取纯度达到98%的NGF表达下调的MSC细胞株或对照组细胞株。在上诉研究基础上，我们完成了体外MSC旁分泌NGF对体外活化态HSC和肝细胞凋亡的影响，同时利用大鼠肝纤维化模型研究MSC旁分泌NGF对体内活化态HSC凋亡的影响。结论是MSC可以通过旁分泌NGF经Notch信号通路抑制体内外活化态HSC的增殖。同时我们了测定HSC凋亡信号通路“NGF-AKt-FOXO-cyclinD-Rb ”与“Akt-FOXO-Bim-Cyto C-Caspase-9,3”的活性及其与HSC凋亡的关系。研究论文发表在Life Science 2011. 89(25-26): 975-81。同时在肝星状细胞的调控研究中，我们发现了NP603（FGFR1酪氨酸激酶的一种新型的强效抑制剂），抑制肝星状细胞增殖，并能够改善大鼠的肝纤维化。研究论文发表在Am J Physiol Cell Physiol. 2011. 301(2): C469-77。