眼镜蛇毒NGF通过信号通路诱导肝星状细胞凋亡的研究

Hepatic stellate cells(HSCs) are the important cells in pathological mechanism of liver fibrosis,whose activation,proliferation,apoptosis and other pathological mechanisms are regulated by signal transductions.Venom nerve growth factor(vNGF) can induce the HSCs apoptosis significantly, and the MAPK signaling pathway plays an important role of regulation in liver fibrogenesis. Does that mean that the NGF effect through the MAPK signaling pathway in liver fibrosis? Which aroused our great interest,and prompt us to further research it continually. Based on our previous series studies,we will use the HSC-T6 cell line,and detect the activity change of MAPK,PI3K/Akt and TGF-β signaling pathway,and its inhibitors' effect to the proliferation, apoptosis and expression of apoptosis related proteins which is the main member in the Bc1-2 family of NGF-induced HSC-T6,and with the use of siRNA technology to slience the genes, detecting the effect to the proliferation and apoptosis of HSCs by NGF,and clarify the mechanism that MAPK signaling pathway involved of regulation of NGF-induced apoptosis of HSCs ,and find important target of the NGF hepatic fibrosis.In sum,this study will provide a new insight into the target and solution for the treatment of hepatic fibrosis.

肝性状细胞（HSCs）作为肝纤维化病理机制中重要的细胞，其激活、增殖、凋亡等病理过程均受信号传导的调控。蛇毒神经生长因子（NGF）可引起明显HSCs凋亡，是否意味着NGF 在肝纤维化中具有重要的调控作用？NGF 在肝纤维化中通过哪些信号通路发生作用？引起了我们极大兴趣和深入研究。基于前期系列研究的基础上，我们拟采用HSC-T6细胞株，研究NGF作用下MAPK和PI3K/Akt信号通路的活性改变，其抑制剂对NGF诱导HSC-T6的增殖、凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2家族主要成员表达的影响，利用RNA干扰技术沉默相关基因，检测NGF对HSCs细胞增殖和凋亡的影响，从而阐明MAPK信号通路参与调控的NGF诱导HSCs细胞凋亡的相关机制，寻找NGF抗肝纤维化作用的重要靶点。本研究将为探索干预肝纤维化新靶点提供新的思路。

肝纤维化是肝硬化、肝癌乃至肝功能衰竭的共同病理基础和必经阶段，是影响慢性肝病的重要环节，是目前国内外学者研究慢性肝病的焦点。肝性状细胞（HSCs）作为肝纤维化病理机制中重要的细胞，其激活、增殖、凋亡等病理过程均受信号传导的调控。蛇毒神经生长因子（NGF）可引起明显HSCs凋亡，意味着NGF在肝纤维化中具有重要的调控作用。我们采用HSC-T6及HSC-LX2细胞株，研究眼镜蛇毒NGF通过PI3K/Akt和TGF-/Smad信号通路对HSC-T6细胞的影响。其抑制剂对NGF诱导HSC-T6的增殖、凋亡及Smad3的磷酸化蛋白表达的影响，检测NGF对HSCs细胞增殖和凋亡的影响，从而阐明MAPK信号通路参与调控的NGF诱导HSCs细胞凋亡的相关机制，寻找NGF抗肝纤维化作用的重要靶点。本研究获得了较理想的实验结果：（1）NGF能通过降低PI3K/Akt、TGF-/Smad中Akt、Smad3的磷酸化表达水平来诱导HSC-T6细胞的凋亡。.（2）PI3K/Akt特异性抑制剂也能抑制Smad3的磷酸化蛋白表达，TGF-/Smad抑制剂也能抑制Akt磷酸化蛋白表达。因此 PI3K/Akt、TGF-/Smad两条通路之间在HSC-T6凋亡机制中可能相互协同。.（3）NGF可能通过调节能影响HSC-T6活化的信号通路的关键蛋白表达量，抑制HSC-T6的增殖、诱导其凋亡。.（4）不同浓度NGF作用HSC-LX2 24h 后，CCK-8 法可检测到HSC-LX2细胞存活率均明显低于空白组（p <0.01）。另流式细胞术检测结果表明，HSC-LX2细胞经NGF、LY294002作用后细胞凋亡率明显高于空白组（p <0.01）。NGF、LY294002作用后的HSC-LX2细胞中Akt 的表达水平与对照组比较无显著差异（p >0.05），而 p-Akt的表达水平明显低于空白组（p <0.01）。提示NGF可抑制HSC-LX2细胞增殖，且其效应随浓度的增加而增强 ，呈量效关系；NGF可促进HSC-LX2细胞凋亡，其作用机制可能与抑制 PI3K/Akt 信号通路的激活有关。本研究将为探索干预肝纤维化新靶点及抗肝纤维化治疗药物研究提供新的思路和方法