百脉根小G蛋白ROP6在根瘤菌侵染过程中的调控机制研究

The formation of nitrogen-fixing nodules between legume plants and rhizobia requires the coordinated development of rhizobial infection and nodule organogenisis, which can be separated genetically. We used the atypical kinase domain of NFR5 (NFR5-PK) as bait to screen a Lotus cDNA library and identified a small GTPase ROP6 in Lotus japonicus. Our primary experimental data demonstrated a role of ROP6 as a regulator of rhizobial infection in L. japonicus. Based on this, we would like to use ROP6 LORE1-insertion mutant, constitutively active mutant (ROP6-CA) and dominant negative mutant (ROP6-DN) as materials to identify the symbiotic phenotype of the mutants, which will help to further clarify the biological function of ROP6. Furthermore, detecting the interaction between ROP6-CA, ROP6-DN and NFR5, testing if the GTPase activity of the mutant proteins would be affected by NFR5 and screening new ROP6-interacting proteins will help to understand the biochemical and biological functions of ROP6. These results will help to illustrate the regulation mechanisms of ROP6 involved in the rhizobial infection process and provide molecular evidence to establish early symbiotic relationship between the rhizobia and leguminous plants.

豆科植物中根瘤的形成是根瘤菌侵染和根瘤器官发生协同作用的结果。遗传学分析表明，根瘤菌侵染和根瘤器官发生可以是两个相对独立的过程。在模式豆科植物百脉根中，申请者以NFR5蛋白的激酶结构域为诱饵筛选到一个小G蛋白ROP6，初步实验表明ROP6在根瘤菌侵染过程中发挥作用。本项目拟在此基础上，以百脉根ROP6的LORE1插入突变体、组成型活化突变体（ROP6-CA）和功能缺失突变体（ROP6-DN）为材料，通过共生表型的鉴定，进一步明确ROP6在根瘤菌侵染过程中的生物学功能。另外，检测ROP6-CA/DN与NFR5蛋白之间的相互作用，研究NFR5对其GTPase活性的影响，筛选与ROP6相互作用的新蛋白，以揭示ROP6的生化功能，阐明ROP6在根瘤菌侵染过程中的调控机制，为根瘤菌与豆科植物早期共生关系的建立提供分子生物学证据。

生物固氮在自然界氮素循环和人类的农业生产中具有十分重要的作用，特别是豆科植物与根瘤菌之间的根瘤共生固氮更是植物获取氮素经济、有效、无环境污染的最佳途径。豆科植物的根感知结瘤因子信号，随后根毛的变形反应如肿胀和卷曲被激活。然而，对于这种根毛变形的分子机制却知之甚少。NFR5（nod factor receptor 5）编码结瘤因子受体激酶，是结瘤因子信号识别和随后根瘤菌特异的激活途径所必需的。先前的研究证明，小GTPases Rho家族的一个成员LjROP6，能够与NFR5相互作用共同参与百脉根共生结瘤。然而在共生结瘤过程中ROP6行使怎样的功能，以何种方式行使功能，是本项目想要解决的关键问题。本项目利用生物信息学方法在百脉根基因组中鉴定了包括LjROP6在内的10个小GTP酶，系统发育分析发现它们属于II，III，IV这3类小GTP酶，都不属于第I类小GTP酶。此外，对10个LjROP基因在结瘤过程中的表达谱进行了检测。LjROP6属于第IV类小GTP酶，以GTP依赖形式与NFR5相互作用。野生型ROP6或组成型活化突变体ROP6-CA均能使根毛顶端生长去极化，而功能缺失突变体ROP6-DN表现出正常的根毛生长。接种根瘤菌或添加结瘤因子至超表达ROP6或ROP6-CA的转基因毛根后，根毛变形现象明显增加，而超表达ROP6-DN抑制根毛变形。超表达ROP6或ROP6-CA导致转基因植株的侵染事件和根瘤数增加，而超表达ROP6-DN减少侵染事件和根瘤数。这些证据强有力的证明ROP6以GTP活化形式结合NFR5，并且参与根毛发育以及共生互作早期阶段结瘤因子诱导的根毛变形反应。本项目揭示了LjROP6在调控根瘤菌侵染过程中的分子机制，从而为根瘤菌与豆科植物早期共生机制的阐明提供了很好的分子生物学证据。