百脉根凝集素类受体激酶LjSDK调控根瘤菌感知及共生信号转导的分子机制

Leguminous plants have developed the capacity to establish symbiotic interactions with rhizobia. The formation of specific nitrogen-fixing nodules requires two complementary developmental processes: bacterial infection and nodule organogenesis. However, the exact mechanism of rhizobia invasion and infection thread formation remains unclear. We identified a gene loss-of-function mutant that exhibits excessive amount of infection threads and reduced nodule numbers, and the corresponding gene LjSDK encodes a lectin S-domain like receptor kinase. Interestingly, we noticed that rhizobial lps β2 strain demonstrated the same phenotype. In this study, we employ the model legume Lotus japonicus as research materials, measure the dissociation constant Kd between rhizobial lipopolysaccharide and LjSDK using the ITC and MST assay. The CRISPR/Cas9 and RNA-seq methods are combined to explore gene co-expression network. Finally, we utilize yeast two-hybrid(Y2H) and immunoprecipitation-mass spectrometry(IP-MS) to identify LjSDK interacting proteins. The execution of this project will clarify the biological function of LjSDK during the process of nodule formation, provide novel insights into the molecular mechanism of LjSDK in regulating rhizobial invasion, and provide scientific basis for elucidating early symbiotic signal transduction during rhizobia-legume interaction.

豆科植物能够与根瘤菌相互识别，形成特异性的固氮器官—根瘤。根瘤的形成依赖于根瘤菌侵染和根瘤器官发生两个相辅相成的过程。目前，根瘤菌入侵和侵染线形成的分子机理尚不明确。我们在模式豆科植物百脉根中鉴定到一个编码凝集素类受体激酶基因LjSDK，其功能缺失突变体表现为表皮根瘤菌过度侵染和根瘤数减少。有趣的是，根瘤菌lps β2突变体接种百脉根表型与sdk突变体一致。本项目拟在此基础上，利用等温滴定量热法(ITC)和微量热泳动(MST)技术测定根瘤菌脂多糖LPS与LjSDK的结合常数，明确二者的配体-受体关系；通过CRISPR构建突变株结合转录组测序分析基因共表达网络；利用酵母双杂交和免疫沉淀等技术鉴定LjSDK互作蛋白，探究LjSDK的分子作用机理。本课题的实施将明确LjSDK在根瘤形成过程中的生物学功能，解析其调控根瘤菌侵染的分子机制，为阐明根瘤菌与豆科植物早期共生信号转导提供科学依据。

受体激酶和受体样蛋白激酶是植物中最重要的蛋白质家族之一，它们通过感知不同的环境信号分子来介导植物体内的信号转导，参与植物发育、免疫以及豆科植物的固氮信号转导等多种途径。LysM类受体激酶在共生结瘤过程中发挥着关键作用，如结瘤因子受体NFR1和NFR5，二者通过形成异源二聚体来结合结瘤因子，起始共生信号在植物细胞内的传递。然而，NFR1和NFR5表现出不同的特征，包括基因表达模式和蛋白激酶活性。本项目研究中，我们鉴定到两个G-type类型的凝集素受体激酶SDK和SDKL (SDK-Like激酶)，它们可以特异性地与结瘤因子受体NFR5相互作用并磷酸化修饰NFR5。sdk和sdkl突变体均表现出结瘤数量减少和侵染线数量显著增加的共生表型。我们通过磷酸化质谱和体外激酶实验鉴定到NFR5的第304位的酪氨酸是一个关键的底物磷酸化位点，可以被SDK激酶特异性磷酸化修饰。我们通过互补实验发现，NFR5-Y304F可以nfr5-3突变体的共生缺陷表型，但是其结瘤数减少和侵染线增加的互补表型与sdk sdkl突变体的共生表型相似。此外，已知的E3连接酶LjPUB13可以泛素化修饰NFR5，我们的研究进一步发现PUB13也可以与SDK和SDKL相互作用，且被SDK蛋白磷酸化修饰，PUB13的泛素化活性受其磷酸化状态的影响。我们的研究表明，SDK和SDKL具有一定的功能冗余性，通过精细地调控NFR5的磷酸化和泛素化状态来调节NFR5的活性，从而调控共生信号的转导。