双生病毒卫星DNA编码的βC1蛋白抑制转录水平基因沉默研究

本项目拟在发现双生病毒卫星DNA编码的βC1能抑制转录水平基因沉默（TGS）的基础上，采用bisulfite sequencing检测感病植株病毒基因组甲基化水平，比较卫星DNAβ存在与否对病毒基因组甲基化的影响；将dex诱导的βC1转化拟南芥，采用半定量RT-PCR、甲基化敏感限制性内切酶-PCR、bisulfite sequencing和甲基化敏感单核苷酸延伸等方法研究βC1对拟南芥内源甲基化沉默基因及拟南芥全基因组甲基化的影响；通过酵母双杂交和双分子荧光互补试验筛选甲基化途径中与βC1互作的寄主因子。本项目从分子生物学和遗传学两方面首次探索病毒卫星DNA编码的βC1抑制TGS的机理，研究结果将为深入剖析RNA沉默机制及病毒与寄主的互作打下理论基础。

DNA甲基化是调控基因表达、抑制内源转座子及抵抗外源入侵DNA病毒的一种基本的表观遗传学修饰方式。作为一种反防御机制，双生病毒编码一些蛋白来抑制寄主植物的甲基化和转录水平基因沉默（Transcriptional gene silencing,TGS）。项目以中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV）及其伴随的卫星betasatellite（Tomato yellow leaf curl China betasatellite, TYLCCNB）为材料，发现TYLCCNB编码的βC1能抑制甲基化介导的转录水平基因沉默。亚硫酸氢盐测序（bisulfite sequencing）表明TYLCCNV基因组DNA在TYLCCNV单独侵染的本氏烟中能够发生甲基化，且甲基化主要集中于病毒启动子区，包括基因间隔区(含有病毒复制起点和双向转录启动子)、AV2区(含有AV1/CP启动子)以及AC2/AC3的启动子区。卫星TYLCCNB与TYLCCNV共同侵染能够降低TYLCCNV全基因组的甲基化水平，使其从5.4%降到1.25%。TYLCCNB能够互补甜菜曲顶病毒（Beet curly top virus, BCTV）L2-突变体，阻止次级侵染组织发生回复，使其胞嘧啶甲基化水平降低15%左右。甲基化链延伸实验表明TYLCCNB与TYLCCNV共同侵染本氏烟使寄主基因组的甲基化水平降低2.5倍左右。卫星TYLCCNB与TYLCCNV或者BCTV L2-突变体共同接种能够回复16-TGS本氏烟中转录水平沉默的GFP转基因的表达，而TYLCCNV本身并不能有效地抑制TGS。βC1蛋白能回复16-TGS 本氏烟中转录水平沉默的GFP转基因的表达，并且能够激活拟南芥中F-box 等内源表观沉默位点的表达，显著降低拟南芥基因组的甲基化水平。酵母双杂交和双分子荧光互补实验表明βC1能够在体内与甲基循环中的关键酶S-腺苷高半胍氨酸水解酶(SAHH)互作。体外SAHH活性测定试验表明βC1与SAHH互作后能够使SAHH的活性降低80%左右，从而抑制甲基化和TGS。