具有聚合活性三联吡啶钌探针的构建及其在体外与原位分子诊断中的应用

Electrochemiluminescence (ECL) technology based on the Ru(bpy)32+ -tripropylamine system is one of the most sensitive analytical tools and has been widely used in clinical molecular diagnostics. Based on the existing ECL detection methods, to explore new ECL detection probes and systems for achieving the sensitivity into the fM range, and the specificity and precision of the detection are ensured and without the increasing of the complexity of the detection apparatus, will be of great significance for detection of low abundance functional biological molecules. To solve this scientific problem, this project proposes the concept of polymerization-enhanced ECL by synthesizing a polymerization-active dopamine (or tyramine)- Ru(bpy)32+ probe. By the mechanism of rapid and efficient polymerization of dopamine (or tyramine)- Ru(bpy)32+ probe to adjacent protein molecules under the catalysis of horseradish peroxidase, we can build a new ECL signal amplification technology platform. Based on the platform, in vitro and in situ analysis of gene detection, antigen/antibody detection, aptamer probe detection, single-cell gene and protein, etc. can be performed. Further combination with CRISPR technology we can build a new ECL in situ hybridization (EISH) method. The success of this research project can promote the academia and industry community to explore new applications that require ultra-high sensitivity detection in areas such as disease diagnosis, environmental monitoring, and food safety using polymerization-enhanced ECL technology.

基于三联吡啶钌-三丙胺体系的电化学发光技术（ECL）是当前最灵敏的分析工具之一，并已被广泛应用于临床分子诊断。在现有ECL检测方法基础上，探索更新型的检测探针和体系，将灵敏度探入fM范围，并保证检测的特异性和精度，不增加检测仪器的复杂程度，将对低丰度生物功能分子的检测具有重要意义。为解决这一科学问题，本项目提出聚合增强的ECL概念，通过合成聚合活性的多巴胺（或酪胺）-三联吡啶钌探针，利用多巴胺或酪胺在辣根过氧化酶的催化下，与邻近蛋白分子发生快速、高效率聚合反应为机理，构建新型的ECL信号扩增技术平台。在该平台基础上，开展基因检测、抗原/抗体检测、适配体探针检测、单细胞基因、蛋白等的体外与原位分析，进一步与CRISPR技术结合，实现ECL原位杂交技术（EISH）等新方法。本研究课题的成功可促使学术界、产业界应用ECL技术来探索一些疾病诊断、环境监测、食品安全等领域需要超高灵敏度检测的新应用。

本项目曾计划开展基于聚合活性功能探针的体外与原位分子诊断技术研究工作，特别强调基于新兴的CRISPR技术开展核酸和免疫检测新方法研究。课题执行期满（4 年）后，基本按照预期计划开展，并取得了一些有特色的研究成果。大部分成果以研究论文的形式发表在领域知名刊物，如JACS, Angewandte Chem. PNAS，Nature Comm. ACS Nano, Aanl. Chem. 等，总计发表论文 11 篇。特别是在改进常规的PCR、LAMP扩增检测平台上取得重要进展，开发出了两类可以解决核酸检测过程中气溶胶污染的高特异性方法。在这些方法的基础上，开发出了基于CRISPR识别的试纸条检测平台，从探针构建，CRISPR核酸识别原理，试纸条平台和病原菌检测应用上展开了系统的研究。此外，在免疫分析中开发出了CLISA检测平台。CLISA方法比常规的ELISA方法灵敏度提高了2个数量级。总之，这些研究方法为体外分子诊断领域提供了全新的视角以及为进一步的工作开展提供了良好的工作基础。基于申请团队在CRISPR分子诊断领域取得的领先成果，项目负责人受权威综述刊物Annul. Rev. Anal. Chem.邀请撰写该领域综述论文。项目整个研究周期内共申请专利 4 项（包括一项PCT专利）。培养博士研究生 3 名，硕士研究生 3 名。