阐明SLC10家族胆酸转运体的结构-功能机理

Bile acid transporters of the SLC10 family are key players mediating enterohepatic circulation of bile acids. The two major components of this family are Na+-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP or SLC10A1) and apical sodium-dependent bile acid transporter (ASBT or SLC10A2). It is of great biomedical significance to study bile acid transporters, because: First, ASBT, primarily expressed in the intestine, is an important drug target for treating various metabolic diseases. Secondly, NTCP, which is almost exclusively expressed on hepatocytes, is found to be a functional receptor for hepatitis B/D virus (HBV/HDV) entry, and targeting the NTCP-virus interface provides a new avenue in battling HBV/HDV infections. Thirdly, bile acid transporters are important carriers for pro-drug design. It has been more than two decades since active drug development targeting NTCP or ASBT was first started, however, the success is extremely limited, partly due to the lack of atomic structural details of bile acid transporters from any high organisms, especially human, and due to unclear structure-function relationships. The current proposal is focused on the structure-function aspects of bile acid transporters and three directions will be pursued: (1) Elucidate the substrate binding and transport mechanism in bacterial ASBT homologs; (2) Determine crystal structures for the human ASBT/NTCP (or ASBT/NTCP from other high organisms) and elucidate the mechanisms for substrate binding and transport; (3) Elucidate the structural basis for the binding and inhibition of inhibitors to bile acid transporters and establish the structure-activity relationship.

胆酸转运体是胆酸肠肝循环的重要决定因子，其主要成员有钠离子牛磺胆盐共转运体（NTCP）和顶端钠依赖性胆酸转运体（ASBT）。研究胆酸转运体具有重要医学意义和应用价值：第一，主要表达于肠道的ASBT是一个重要的药物靶点，可用于治疗多种代谢类疾病。第二，表达于肝细胞的NTCP是介导乙肝/丁肝病毒感染肝细胞的重要受体，因此阻断这一结合可为防范乙肝/丁肝提供新手段。第三，胆酸转运体是前体药开发设计领域的重要载体蛋白。胆酸转运体相关的药物研究历时已二十余年，取得的突破却十分有限，其中一个重要原因是对于高等生物胆酸转运体的结构一无所知且结构-功能关系不明确。本项目拟围绕胆酸转运体开展以下三个方向的研究：（1）阐明原核ASBT同源蛋白的底物结合位点和转运机制；（2）深入解读人源等高等生物胆酸转运体的蛋白结构及底物结合转运机制；（3）阐明胆酸转运体抑制剂结合与抑制的结构机理，建立构-效关系。

顶端钠依赖型胆酸转运体（ASBT，或SLC10A2）介导胆酸在回肠腔内的回收，对于胆酸的肝肠循环至关重要。靶向ASBT为治疗某些代谢类疾病如二型糖尿病、高胆固醇血症、家族性胆汁淤积等提供了新的方向。到目前为止，高等生物ASBT原子结构尚未解析，高精度晶体结构仅见于两个原核ASBT同源蛋白（ASBTNM和ASBTYf）。原核ASBT同源蛋白结构为整个ASBT家族的蛋白折叠和底物转运机制提供了很有价值的信息，但关于胆酸底物确切的结合位点和结合机制仍然未知，严重妨碍了以其结构为指导进行抑制剂类药物设计和优化的研究。另一方面，进一步解析高等生物ASBT原子结构无疑会为ASBT的机理研究和药物研发产生有力推动。. 因此本项目原计划围绕三个方向内容进行研究：（1）阐明原核ASBT同源蛋白的底物结合位点和转运机制；（2）深入解读人源等高等生物胆酸转运体的蛋白结构及底物结合转运机制；（3）阐明胆酸转运体抑制剂结合与抑制的结构机理，建立构-效关系。后立项时由于调整执行周期（4年期调整为2年期）和经费总额（74万元调整为25万元），本项目研究内容亦相应作了缩减调整，并在执行中着重投入内容（1）与内容（2）的研究，以期短期内获得突破并完成项目目标。. 一方面，我们以原核同源蛋白ASBTYf为研究重点，通过设计引入二硫键的方法将ASBTYf锁定在多种构象中，包括向内开放、向外开放、以及一个新颖的封闭构象，并解析了6个不同结构，且其中有5个结合有类似配体的酸性分子。结合分子对接模型和充分的结合常数测定，我们提出了一个新颖且统一的底物结合机制模型，并进行了有效验证。我们的底物结合模型同时对底物转运机制进行了扩充和修正，并阐释了钠离子可能的释放机制。另一方面，我们对35种高等生物ASBT同源蛋白进行了广泛而深入的表达筛选、蛋白工程改造、纯化结晶尝试，并成功获得了一个表达量尚可且状态较稳定的蛋白，但由于时间和经费的限制，我们尚未能获得衍射良好的晶体来解析其结构。. 本项目结果进一步阐明了ASBT的底物结合和转运机制，对结构辅助的ASBT药物研发有重要指导意义，并为将来高等生物ASBT结构解析工作铺平了道路。