虾夷扇贝抗逆SNP标记的开发

虾夷扇贝是我国北方重要的经济贝类之一，近年来，该种养成中的死亡问题给养殖者带来了巨大的经济损失，其明显滞后的分子遗传学基础研究也阻碍了该种的遗传改良进程。目前，有关虾夷扇贝SNP与抗逆性状相关性的研究未见报道。本项目在已得到虾夷扇贝G－型溶菌酶、大防御素、 CuZn过氧化物歧化酶、硫氧还蛋白等抗逆相关基因cDNA序列的基础上，首先通过基因步移等技术得到这些基因的5'侧翼区，筛选其中的SNP位点。通过实时定量PCR技术以及高分辨率熔解曲线突变检测技术，运用混合模型方程组的建立与迭代求解法研究多个SNP协同作用于该基因时的表达量的变化，筛选出与基因表达量显著相关的SNP组合。最后，通过多个家系的构建并检测其发育生长过程中各家系SNP基因型频率的变化，确认抗逆SNP组合。本项目得到的与抗逆能力显著相关的SNP组合，有望直接指导该种的遗传改良和品种选育。

项目组首先通过文库内原有序列信息，配合同源克隆和RACE等方法克隆了虾夷扇贝goose-type lysozyme、TRAF6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6）、Hsp 70（heat shock protein 70）和LITAF（Lipopolysaccharide-induced TNF-alpha factor）的cDNA全序列。其次在用急性攻毒试验结合real time PCR定量技术验证上述基因参与对致病菌的免疫过程后，用基因步移法获取了部分基因的启动子序列并通过测序比对筛选了这些基因启动子和编码区序列的SNP。结果表明：在虾夷扇贝glutathione peroxidase基因的5’侧翼区发现3个高频SNP，而goose-type lysozyme基因的5’侧翼区存在两种单倍型，TRAF6基因的5’侧翼区则分布有3个SNP，在Hsp 70基因编码区共有46个SNP位点，其中有12处SNP变异引起了编码氨基酸的改变（有义突变）。通过过量注射查氏弧菌区分出了易感个体和抗逆个体，通过测序和电泳确定了这两种个体中上述SNP(或单倍型)的分布情况，利用卡方检验计算这两种个体中SNP(或单倍型)的分布差异，最终确定在Hsp 70中的一个有义突变SNP与个体的抗性显著相关。在项目的支持下发表两篇科研论文，一篇国外SCI期刊，一篇国内核心期刊，基本完成了预期研究目标。