功能获得性突变 Gly701Ala 和 Gly701Thr 制备新型高活性凝血因子VIII的可行性

Coagulation Factor VIII (FVIII) with higher activity minimizes the risk of inhibitor development and reduce cost of hemophilia A therapy. Activated FVIII (FVIIIa) is very unstable and can only exist less than 2 minutes. FVIIIa is composed by non-covalent linked A1, A2, and A3C1C2 domains and separation of A2 domains leads to its inactivation. It has been shown that increased affinity between A2 and A3 domains stabilized FVIII molecule and improved Its activity. Amino acid residue Gly701 does not directly involved in dimer interface interaction between A2 and A3 domains, however, it helps formation of an alpha helix (composed by amino acid residues 698-703) within A2 and A3 interface. Glycine does not have side chain and is the smallest amino acid residue. This structural property make glycine one of the most flexible amino acid and weak point in maininting alpha helix structure. Whether mutations at Gly701 will yield a hyperfunctional FVIII molecules by stabilizing alpha helix structure and A2/A3 interaction is an intriguing question. We found that substitution Gly701Ala and Gly701Thr conferred better thermostability and superior coagulation activity to FVIII molecule in preliminary studies and it is interesting to explore how these amino acids replacement help to maintain stability of A2 domain and whether there are other mechanism responsible for this enhancement of activity. In proposed studies, we also try to examine in vivo efficacy, elimination and antigenicity of these mutants on hemophiliac mouse models.

临床中需要开发新型高活性FVIII以降低血友病A替代治疗中抑制物产生风险。活化的FVIII（FVIIIa）由A1,A2, A3C1C2结构域非共价结合组成，极不稳定，当A2结构域解离时，FVIIIa即失活。因此增强A2和A3 结构域之间的亲和力是提高FVIII凝血活性的一条重要的研究策略。甘氨酸没有侧链，是导致α螺旋结构被破坏的薄弱位点，因此是否可以对A2／A3结构域结合面上的氨基酸残基Gly701进行突变，以更好的维持其所参与组成的α螺旋结构，从而稳定FVIIIa分子，便成为改良FVIII制剂的一个极有希望的研究方向。前期研究发现FVIII突变体Gly701Ala 和 Gly701Thr具有更好的稳定性和凝血活性，在此基础上我们将探索这些功能获得性突变稳定FVIII结构，提高其活性的机制，并在血友病A小鼠模型中评估其止血活性，药代动力学及免疫特性。为新型FVIII制剂的研发提供依据。

对凝血因子结构和功能的认识以及在此基础上对凝血因子进行的改造是提高临床遗传性出血性疾病（如血友病）替代治疗效果和开发基因治疗方案的关键。本研究前期工作中发现凝血因子VIII突变体G701A和G701T相较于野生型蛋白具有更强的凝血活性。以此发现为线索，本研究建立完善了凝血因子的蛋白表达纯化技术平台; 初步引入了蛋白结构分析分子动力学模拟技术平台; 探索出了凝血相关蛋白酶动力学分析平台; 建立了体内凝血功能评估止血动物模型平台, 对FVIII 突变G701A和G701T的凝血功能活性进行测定以及结构功能学分析, 并将该研究技术平台应用于相关凝血因子的研究。本研究进一步尝试了应用重组腺相关病毒载体（AAV)基因治疗制备技术，进行高活性凝血因子血友病基因治疗的尝试。同时，本研究还对抑制物抗体产生的机制进行了探讨。课题组首先对FVIII突变体 G701A和G701T的酶动力学特性进行了分析，证明了两种突变均未影响凝血因子VIII的活化，而其辅酶活性则较野生型有比较明显的提升，显示了将其应用于替代治疗和基因治疗中的良好前景。课题组在国际上首次阐明了新型的凝血酶原突变R341W导致的凝血酶促凝和抗凝功能的失衡是其使血液高凝而产生血栓的主要机制。应用易栓症患者中发现的高活性凝血因子IX所建立的AAV基因治疗方案在小鼠体内持久稳定地纠正了凝血功能缺陷，与国外同类研究相似。本研究在国际上首次提出母婴微嵌合所产生的免疫诱导耐受效应，是部分血友病A患者免于产生抑制物的机制之一。 研究结果分别于ISTH与ASH进行大会发言交流，并总结发表于blood advances, ATVB和Haematologica.等学术期刊，部分被选为当期封面。