B结构域在凝血因子VIII分泌过程中的作用及机制研究

Haemophilia A is the most popular inherited bleeding disorder caused by deficiency or dysfunction in coagulation factor VIII. Protein replacement is the most effective therapy. However, the plasma derived FVIII may increase the virus infection risk, and the secretion efficiency of the recombinant FVIII by eukaryotic cells is low. So, many of the HA patients couldn’t receive enough FVIII. Studies illustrated that B-domain played an important role in the secretion of FVIII. But the mechanism is unclear yet. In our preliminary research, we found B-domain deletion could affect the secretion of FVIII. We constructed plasmids of mutation in heavy chain and light chain of full length FVIII respectively. When we transfected both of the mutant plasmids at the same time, we got the FVIII with activity. Meanwhile, we constructed the same mutation in heavy chain and light chain of B-domain deleted FVIII plasmids respectively. No active FVIII was obtained when we transfected cells with both of the plasmids. Furthermore, the results of fluorescence resonance energy transfer (FRET) suggested that B-domain might mediate the domain-cross of FVIII. So, we assume that B-domain may mediate the domain-cross of the FVIII and the structure is needed for the secretion of FVIII. This study would focus on the role and mechanism of the B domain in forming the domain-cross of FVIII and in the secretion of FVIII by the means of biochemistry, cell biology techniques and HA mice models. The study would help to illustrate the related structures and mechanism of the FVIII secretion, which might be able to provide theoretical basis of manufacturing FVIII with high efficiency in secretion.

血友病A是凝血因子Ⅷ(FⅧ)量或功能缺陷所致的最常见遗传性出血病。替代治疗是目前最有效的治疗方法，但血浆来源FⅧ增加患者病毒感染风险，而重组FⅧ真核分泌量低。因此多数患者无法接受到有效替代治疗。研究认为B结构域在FⅧ分泌过程中起重要作用，但机制未明。我们前期研究显示，B结构域缺失可影响FⅧ分泌。当共转染分别含重链及轻链突变的全长FⅧ质粒后可获得具有活性的FⅧ。而共转染带相同突变的B结构域缺失FⅧ质粒则未获得有活性的FⅧ。以荧光共振能量转移技术检测提示B结构域可介导FⅧ形成二聚体。因此我们推测B结构域可介导FⅧ二聚体形成，而该结构为FⅧ有效分泌所需。本研究将通过细胞生化技术结合血友病A小鼠模型，明确B结构域在介导FⅧ形成二聚体中的作用及其调控机制，探究B结构域在FⅧ分泌中的作用及机制。项目的完成有助于阐明FⅧ分泌过程中的相关结构及作用机制，为临床研发高效分泌的FⅧ提供理论依据。

血友病A是凝血因子VIII (FVIII)量或功能缺陷所致的最常见遗传性出血病。替代治疗是目前最有效的治疗方法，但血浆来源FⅧ可增加患者病毒感染风险，而重组FⅧ真核分泌量低。因此多数血友病A患者无法接受到有效替代治疗。探讨FVIII分泌过程中的关键结构及机制有助于研发具有高效分泌的FVIII，对临床血友病A患者的FVIII替代治疗具重要意义。研究认为，B结构域在FⅧ分泌过程中起重要作用，但机制未明。本课题首先构建了分别含重链及轻链突变的全长FⅧ质粒，当单独转染细胞时，细胞分泌FVIII均无活性，而将两者共转染细胞时可分泌出有活性的FⅧ，初步提出B结构域可介导FVIII分子间形成二聚体结构并参与分泌。同时，我们利用免疫共沉淀实验及荧光共振能量转移技术（FRET）证实B结构域介导FVIII二聚体形成。据报道，FXI的A4 结构域在FXI二聚体结构形成中具重要作用，该结构域较FVIII的B结构域小，更易于表达，因此我们构建FXI A4结构域替代FVIII B结构域的FVIII-FXI-A4-HA及FVIII-FXI-A4-Flag质粒，探讨该结构域是否能参与FVIII分子二聚体形成及分泌。通过细胞表达、免疫共沉淀及FRET验证了嵌合FXI-A4结构域的FVIII可形成二聚体并参与FVIII有效分泌。最后，我们分别将各不同质粒注射入4-8周的HA小鼠体内进行体内验证，于不同时间点采血检测FVIII蛋白表达及活性，验证FVIII二聚体形成在其分泌中的作用。结果显示携带了FXI A4结构域突变的嵌合FVIII质粒可提高HA小鼠的FVIII分泌能力且可以持续表达。因此，本研究通过体外功能试验及HA小鼠体内试验验证了B结构域可介导FVIII二聚体结构形成并参与FVIII有效分泌，通过FXI A4结构域在FVIII中的嵌合进一步验证二聚体结构形成在FVIII有效分泌中的关键作用，为临床制备高效分泌的FVIII提供理论依据。