构建胰腺癌BxPC-3高淋巴转移潜能细胞三维癌巢模型及其微环境特性研究

胰腺癌恶性程度高，淋巴转移是导致预后差的主要因素。我们前期获得胰腺癌BxPC-3高淋巴转移潜能细胞，并研发新型三维培养系统，本课题基于此，拟将高淋巴转移潜能细胞导入新型三维细胞培养系统，构建胰腺癌高淋巴转移潜能细胞三维癌巢模型，模拟体内肿瘤细胞微环境。通过：（1）主动调控微环境细胞组成和基质成分，动态观察细胞生长分化成瘤、趋化迁移过程；（2）进行肿瘤细胞微环境代谢组学研究，利用液相质谱联用技术，分析微环境中细胞代谢分泌的细胞因子产物，研究淋巴转移相关黏附分子和基质降解酶的表达变化；（3）进行微环境肿瘤细胞免疫原性试验，检测肿瘤细胞表面分子物的表达，寻找胰腺癌具有高淋巴转移潜能的细胞特异抗原。阐明新型三维培养体系用于胰腺癌侵袭转移基础研究的价值，通过分析肿瘤微环境特性探索胰腺癌淋巴转移机制，为将来潜在的新型干预治疗实验奠定基础。

胰腺癌恶性程度高，淋巴转移是导致预后差的主要因素。本课题利用三维培养体系探索胰腺癌淋巴转移机制，共获得（含申请号）相关专利三项：开发研制成一种具有自主知识产权的三维细胞培养装置（中国专利申请 200610023537.5，PCT 专利申请PCT/CN2006/000432），它由装有液态细胞培养基的容器和三维细胞培养单元构成，可以为细胞提供一个良好的体外三维生长空间，模拟细胞自然生长聚集的过程。通过该培养体系联合动物实验，成功获得一种具有淋巴道高转移活性的胰腺癌细胞系BxPC-3-LN(国家发明专利申请号：201110383666.6)。该细胞系具备特殊的淋巴转移生物学表型，接种于裸鼠爪垫可发生100%（腘窝、腹股沟、髂血管旁、腹主动脉旁、肾周、肠系膜淋巴结两组以上）淋巴结转移，是国内首例具有高淋巴道转移潜能的人胰腺癌细胞系。.本课题应用三维培养体系来研究胰腺癌淋巴转移特性、微环境并发现相关调控分子，为了验证三维癌巢模型的应用价值，我们比较了两维培养条件和三维培养状态下的细胞多种特性的变化，发现高淋巴转移细胞体外活性在传代四轮后逐步衰减，而三维培养癌巢模型可始终维持并达到与裸鼠体内建模试验相一致的结果，而且与体内建模比成瘤时间明显缩短。具体研究指标包括：三维培养状态下（1）形态：扫描电镜检测发现高转移细胞形态明显异形。（2）倍增时间明显快于两维培养（3）细胞G1期57.6%，S期23.9%，G2-M期18.7%。（4）细胞迁移和侵袭力明显增强，而粘附力降低。（5）原位成瘤能力明显强于两维培养细胞。（5）基因表达谱检测发现明显上调的基因包括TIMP1， FLNA等，表达下调的包括PCDH20， PCDH7等。（6）三维环境代谢分泌产物检测发现，癌巢三维模型中分泌的肿瘤标记物（CA19-9、CEA、CA125等）明显高于原代和低转移潜能细胞两维模型。(7) 微环境中肿瘤细胞免疫原性研究，生物质谱技术鉴定得到14个差异表达蛋白，其中Stathmin特异性蛋白在高转移活性细胞系BxPC-3-LN三维癌巢模型中的表达尤其增高。最后我们还对高淋巴转移细胞BxPC-3-LN，初步进行干细胞特性研究，发现BxPC-3-LN内含有较高比例的CXCR4和CD133双阳性细胞。本课题阐明了新型三维培养体系用于胰腺癌侵袭转移基础研究的价值，为探索胰腺癌淋巴转移机制提供一个较理想研究平台。