广西地方特色的鼻咽癌高淋巴结转移细胞株构建及其淋巴结转移机制的探讨

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)是两广地区常见的恶性肿瘤，早期淋巴结转移是其主要生物学特征也是影响患者预后的主要原因之一，而逐渐成为国内外研究热点,为了研究鼻咽癌淋巴结转移机制，本项目将通过裸鼠移植瘤模型、Transwell侵袭实验等构建具有本地遗传特色的鼻咽癌高淋巴结转移细胞株，并经全自动细胞图像分析系统、免疫荧光染色等先进技术鉴定其EB病毒感染、细胞来源及遗传背景等状况；通过高淋巴结转移细胞株与人脐静脉内皮细胞、淋巴管内皮细胞株的共培养，利用悬浮液态芯片及激光共聚焦系统探讨其互作关系；通过基因表达谱芯片、甲基化区间位点扩增技术、MALDI成像等技术筛选鼻咽癌淋巴结转移的关键分子及差异表达标志物。该项研究的成功实施将构建起具有广西特色的的淋巴结转移机制研究平台，为进一步深入探讨鼻咽癌淋巴结转移机制奠定基础。

鼻咽癌是中国南部特别是两广地区常见的头颈部恶性肿瘤，早期淋巴结转移是其最主要特征严重影响患者的预后，探索研究鼻咽癌淋巴结转移机制对早期发现、延缓甚至是控制鼻咽癌淋巴结转移及判断鼻咽癌患者预后具有十分重要的意义。但是目前，我们对鼻咽癌淋巴结转移的分子机制研究仍不是十分清楚。近年的研究发现，在鼻咽癌淋巴结转移过程中，肿瘤诱导淋巴管生成是一个必要条件，上皮细胞间质转化、瘤内淋巴管及血管生成、前哨淋巴结脉管系统的重组等微环境的改变发挥了极其重要的作用。本研究项目取祖籍及三代内均居住于广西的鼻咽癌患者组织标本，进行BALB/c裸鼠皮下移植，构建广西地区人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型，并在裸鼠体内不断传代，筛选具有淋巴结转移潜能的进行体外细胞原代培养，并进行病理、EBV感染及血管淋巴管生成标志物等鼻咽癌相关生物学指标的检测。结果成功构建了鼻咽癌移植瘤模型，病理结果与临床样本保持一致，多次传代后仍保持EBV潜伏感染状态，在伴有淋巴结转移的原位肿瘤及淋巴结转移灶中淋巴管及血管生成因子等明显表达增强。由于鼻咽癌所处的鼻咽部结构特殊，周围有大量的淋巴组织及淋巴管构成的咽淋巴环，使得鼻咽癌上皮细胞与淋巴管内皮细胞有更多的接触机会，其微环境的特殊性是否与它的淋巴结转移相关，而其启动途径如何是本课题项目的主要研究内容。本研究通过活细胞工作站观察人鼻咽癌高淋巴结转移细胞株5-8F与人淋巴管内皮细胞LEC的交互作用，发现两者的共培养会明显促进5-8F细胞的迁移，直接接触共培养表现更为明显。部分细胞变形，迁移能力增强，表现为亲淋巴结转移倾向。我们在动物实验中亦证实，两种细胞共培养后接种裸鼠出现更为明显的淋巴结转移，而接种部位的肿瘤增殖速度却较单纯接种鼻咽癌细胞的明显减慢。在小管形成实验中我们也发现5-8F细胞与LEC细胞间存在明显的吸引作用，倾向于共同构成淋巴管管壁。为了进一步研究其交互作用机制，本课题组利用分选型流式细胞仪技术将共培养48h的两种细胞分选出来，分别进行表达谱测序及蛋白抗体芯片筛查，结果显示共培养后两种细胞在mRNA及蛋白水平均出现一定的变化，差异基因及蛋白主要富集在MAPK信号通路、TGF-beta信号通路以及细胞粘附、细胞趋化因子、血管生成因子等多个方面，部分分子得到实时荧光定量PCR及免疫组化实验的验证 。而每一条富集的差异基因通路的在鼻咽癌淋巴结转移中的具体机制将在后续深入研究。