基于LC-MS/MS非标记定量法对大黄素抑制人慢性粒细胞白血病细胞耐药作用机制研究

Tumor multidrug resistance is the problem in chronic myeloid leukemia (CML) treatment. Our previous research showed that emodin could inhibit drug-resistance in CML cell lines with the mechanism of multi-target actions. However, the pathways as well as their relationships could not be effectively elucidated by the present research model of single target. A label-free quantitative approach based on LC-MS/MS is a new tool in the separation and analysis of proteins and peptides with high automation, sensitivity, reproducibility and reliability. In this research, this approach will be used for the mechanism, pathways and relationship proteins of emodin inhibiting multidrug resistance in K562/A02 and K562/G01 chronic myeloid leukemia cell lines. Furthermore, the molecular biotechnologies of realtime-PCR and western-blotting will be applied for the verification of the experimental results. These results will elucidate the mechanism of emodin inhibiting multidrug resistance in CML cell lines, and provide the theoretical basis of the development of inhibitors with efficiency and low toxicity in CML treatment. A label-free quantitative approach based on LC-MS/MS could possibly be a new research model of the drug mechanism and targets.

肿瘤耐药是慢性粒细胞白血病（CML）治疗中的难题。本项目组前期工作表明大黄素能抑制CML细胞株耐药，作用机制具有多靶点性，而目前单一靶点研究模式无法有效阐明其作用途径及相互关系。基于LC-MS/MS的非标记定量法是一种蛋白质和多肽分离分析的新手段，自动化程度高，灵敏度和重复性好，数据可靠。本研究拟采用该法对大黄素抑制CML耐药细胞K562/A02、K562/G01作用机制进行研究，寻找大黄素作用于CML细胞耐药相关蛋白可能的通路和靶点，并采用realtime-PCR、western-blotting等分子生物技术进行验证，从而阐明大黄素抑制CML耐药的作用机制，为寻找和开发高效低毒的CML耐药抑制剂提供理论依据，也为药物作用机制研究和靶点寻找提供新的研究模式。

慢性粒细胞白血病（CML）是一种常见的血液系统恶性肿瘤，发病率约占白血病的20%。伊马替尼是针对CML分子靶点Bcr-Abl设计的治疗药物，是临床治疗CML的一线药物，但在临床中发现该药易出现耐药。因此，有必要寻找有效的CML耐药抑制剂。.大黄素(emodin，1, 3, 8-trihydroxy-6-methylanthra-quinone) 是从蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.的根茎中提取出来的有效成分，具有广泛的药理作用。近年来，研究表明，大黄素不仅具有抗肿瘤活性而且还可以增强抗癌药药效。前期研究表明，大黄素具有抑制CML耐药的活性，其作用机制是多靶点、多途径的，但现有研究结果仅靠单一靶点的研究模式，无法有效阐明其作用途径及相互关系，有必要进一步深入研究大黄素抑制耐药的机制。.目前对于药物作用机制蛋白高通量多靶点的研究可采用蛋白质组学分析的方法。蛋白质组学主要研究生物系统表达的蛋白及外因引起的差异蛋白改变，可比较肿瘤耐药细胞体系中正常状态下以及药物处理后蛋白的差异变化，发现新的、潜在的疾病和药物作用靶点，阐明疾病和药物作用机制。.本课题探讨了CML耐药和大黄素抑制耐药的机制，以人慢性粒细胞白血病敏感细胞株K562及其耐药细胞株K562/G01和K562/ADM为实验材料，在大黄素抑制K562耐药细胞株的药效学研究中，评价了大黄素抑制CML耐药株增殖的能力，和促进伊马替尼对K562/G01和阿霉素对K562/ADM的凋亡诱导能力；采用基于LC-MS/MS定量蛋白质组学技术，分析比较大黄素作用下CML细胞(K562对照组、K562/ADM对照组、K562/G01对照组、K562/ADM大黄素受试组和K562/G01大黄素受试组)的差异分泌蛋白和细胞内蛋白，结果显示，差异分泌蛋白有243个和细胞内蛋白有5821个，并通过生物信息学分析筛选出有意义的耐药相关蛋白；采用western blot方法验证了大黄素降低K562/ADM细胞P-gp蛋白的表达，经罗丹明123、大黄素等摄取实验表明大黄素可能作为P-gp的底物，竞争R位点抑制P-gp的外排功能，验证了不同剂量的大黄素能显著降低K562/G01耐药细胞株中Bcr-Abl, STAT5总蛋白和基因表达及其两者磷酸化表达量。为大黄素抑制耐药机制研究及高效低毒的CML耐药抑制剂开发提供理论依据。