ARF6调控慢性粒细胞白血病细胞增殖和耐药的机制研究

Although tyrosine kinase inhibitors (TKIs) are effective for treating chronic myeloid leukemia (CML), CML patients treated with TKIs often generate drug resistance because of deregulation of new genes. Therefore, defining the mechanism of CML in drug resistance and finding novel targets are required to cure CML. Previous studies found down-regulation of ARF6 in K562 cells significantly inhibits cell proliferation and enhances the therapeutic effects of Imatinib and Ara-c. Therefore, we hypothesized that ARF6, as a key factor of BCR-ABL downstream pathway, promotes the proliferation and drug resistance of CML. In this study, we will firstly investigate whether the active ARF6 is required for the proliferation and drug resistance of CML using K562 cells and primitive CML cells from transgenic mice as cell models. Secondly, we will define the mechanism that BCR-ABL/ARNO activates ARF6 to promote the proliferation and drug resistance of CML through molecular biology methods and proteomics strategy. Finally, we will measure the therapeutic effects of ARF6 inhibition treatments by mouse work in parallel with experiments performed on human patient samples. These results will provide the important information for drug development targeting CML and clinical therapies.

靶向癌基因BCR-ABL的酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）已成为治疗慢性粒细胞白血病（CML）的首选药物，但长期服用TKIs容易使CML产生新的基因变异而耐药。因此，阐明CML的耐药机制和发现药物新靶点具有重要意义。我们的预实验结果显示下调人CML细胞系K562中ARF6基因表达能明显抑制细胞增殖和增强TKIs诱导的细胞凋亡。结合文献报道和我们大量的前期研究工作，我们推测ARF6 是BCR-ABL下游调控CML细胞增殖和耐药的关键分子。本项目将以K562和转基因小鼠原代CML细胞系为细胞模型，明确ARF6活化对CML细胞增殖和耐药的影响；通过分子生物学和蛋白质组学等方法，阐明BCR-ABL 通过ARNO激活ARF6促进CML细胞增殖和耐药的分子机制；利用白血病小鼠模型和CML临床病人样本，探讨阻断ARF6活化对CML的治疗作用，最终为靶向CML的药物开发和临床治疗提供新的思路和候选靶点。

靶向癌基因BCR-ABL的酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）已成为治疗慢性粒细胞白血病（CML）的首选药物，但长期服用TKIs容易使CML产生新的基因变异而耐药。因此，阐明CML的耐药机制和发现药物新靶点具有重要意义。.通过ARF6条件型基因敲除小鼠和ARF6Q67L转基因小鼠模型，我们首次证实ARF6在造血细胞中敲除促进了小鼠成年造血干细胞的增殖而不影响造血分化；而ARF6活化不影响小鼠稳态造血却抑制了5-FU诱导的小鼠应急造血。通过构建ARF6基因缺失和ARF6活化的慢性粒细胞白血病（CML）细胞系，我们证实ARF6基因缺失和ARF6活化都能抑制CML细胞的增殖和克隆形成，体内实验也证实ARF6基因缺失和ARF6活化抑制了小鼠CML的发生，同样的研究结果也在AML细胞的研究中被证实。分子机制的研究证实，BCR-ABL 能磷酸化ARNO第326位的酪氨酸，进而激活ARF6，活化下游的Rac1，促进STAT5核转位，上调细胞周期和耐药基因表达，从而促进CML细胞增殖和耐药；而ARF6活化以后，促进了细胞周期抑制基因P19的表达，抑制CML细胞增殖。在人CML细胞系K562中下调ARF6基因表达也能明显抑制细胞增殖和增强Imatinib诱导的细胞凋亡。同时我们也利用大肠杆菌表达系统表达了截断型ARNO，通过与穿膜肽（TAT）融合表达，使其穿过细胞膜，在胞浆内阻断ARNO活性，抑制ARF6活化，抑制包括K562细胞在内的各种肿瘤细胞的增殖。总之，本研究证实了BCR-ABL通过直接磷酸化ARNO，激活下游ARF6-Rac1-STAT5信号通路促进CML细胞增殖的分子机制，并尝试制备了靶向多肽，为CML药物开发和靶向治疗奠定了基础。