大黄素及其衍生物对慢性粒细胞白血病干细胞的作用研究

慢性粒细胞白血病（CML）是起源于骨髓多能造血干细胞的恶性克隆性疾病。分子靶向药物伊马替尼（IM）是BCR-ABL的酪氨酸激酶抑制剂，已广泛用于CML治疗，但由于耐药及不能清除白血病干细胞，IM不能治愈CML。我们前期的研究结果显示大黄素能抑制慢性粒细胞白血病K562细胞增殖及诱导细胞凋亡。PI3K、NF-кB信号转导通路可能参与大黄素诱导细胞凋亡作用。我们前期合成了大黄素衍生物- - - - 大黄素二正辛基季胺盐，具有比大黄素更好的抗肿瘤活性。在此基础上，本课题拟研究中药大黄素及其衍生物对CML干细胞增殖、凋亡的影响，与伊马替尼联用能否通过有效诱导白血病干细胞凋亡，从而清除恶性克隆，探讨其中涉及的PI3K信号转导通路的变化。为大黄素在今后慢性细胞白血病临床治疗上应用提供实验依据。

本课题研究中药大黄素及其衍生物E-19对CML干/祖细胞增殖、凋亡的影响作用，及信号转导通路的变化。.实验内容：. 1）CML干/祖细胞的分离与培养 ：采集8例临床确诊慢性粒细胞白血病患者（5例慢性期，3例急变期）骨髓或外周血，分离单个核细胞，用免疫磁珠(MiltenyiBiotec,Auburn, CA)分离LSC细胞（CD34+/CD38-），分选结束后，标记CD34-PE抗体、CD38-FITC抗体，检测分选流式细胞仪检测分选效率,同时以4个正常供者的外周血干细胞作为对照。采用无血清培养基SFEM培养。. 2）大黄素及其衍生物E-19处理后检测细胞增殖、凋亡情况:MTT法、克隆形成实验、Annexin V-FITC法检测。. 3) 检测细胞凋亡及与凋亡相关蛋白变化。 4）BCR-ABL蛋白及有关增殖、凋亡蛋白表达变化。. 5）PI3K信号转导通路在大黄素及其衍生物作用于CML白血病干细胞过程中的变化。 实验结果：. 大黄素及其衍生物E-19抑制CML CD34+细胞增殖，且呈时效、量效关系。大黄素对CML CD34+细胞抑制作用明显强于正常造血干细胞，且对CD34+的抑制作用强于CD34-细胞，表明对CML干/祖细胞有较强的特异性。能够诱导CML CD34+细胞凋亡。大黄素及其衍生物E-19作用后 下调P210Bcr-Abl , p-P210Bcr-Abl ；检测凋亡相关分子：caspase3的活性片段上调，PARP前体下调，活性片段上调，Bcl-2下调,Bax上调；下调PI3K/AKT信号通路AKT、ERK、p70及其磷酸化蛋白表达。.结论： . 大黄素及其衍生物能有效抑制CML干/祖细胞的增殖、诱导凋亡。其作用机制可能是多方面的，包括下调P210Bcr-Abl 及磷酸蛋白，调节细胞凋亡相关蛋白，以及PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达。.不足之处：.由于时间紧促，例数偏少。对其作用机制研究不够深入，实验中发现大黄素作用后Bcr-Abl mRNA表达无明显变化，但P210Bcr-Abl 蛋白的表达明显降低，推测其作用位点在蛋白翻译或修饰过程，这有待进一步研究。