ORF48催化铜绿假单胞菌噬菌体PaP1甲基化的作用与机制

Bacteriophages (phages) are parasites of bacteria, and this special relationship provides a wonderful model for research of interaction between organisms. However, the underlying mechanisms of phages antagonizing host bacteria and surviving within host cell remain to be interpreted. DNA methylation, as one of the most important basis of epigenetics, plays critical roles in gene regulation and antagonism between organisms. Currently, researches about phage methylation and its role in antagonizing host bacteria are very limited. Our research group previously characterized a lytic phage of Pseudomonas aeruginosa, named as PaP1. Single-molecule sequencing revealed N6-methyl adenines (m6A) in the PaP1 genome. Further investigation suggested that ORF48 of PaP1 is a putative m6A methyltransferase. To identify the exact function of ORF48, in this project, we plan to dissect the PaP1 methylome, characterize the function of ORF48 as a methyltransferase and its zymologic features as well as recognition motifs, and reveal the underlying mechanisms of PaP1 m6A formation via motif pasmid construction, gene knock-out and complementation and single-molecule re-sequencing. Our findings will provide basis for studies of phage epigenetic regulation and the mechanisms of phage antagonizing host bacteria.

噬菌体与宿主菌的寄生关系提供了极佳的生物相互作用研究模式，然而噬菌体拮抗宿主菌并在其内生存的机制有待深入阐明。DNA甲基化修饰是生物体表观遗传学的重要基础之一，在基因表达调控、生物拮抗中发挥重要作用。目前，对噬菌体甲基化修饰及其在拮抗宿主菌中作用的研究甚少。课题组前期分离鉴定了一株裂解性铜绿假单胞菌噬菌体PaP1，单分子测序证实其基因组中含6-甲基腺嘌呤（m6A）修饰，进一步分析发现噬菌体编码的ORF48是一推定的m6A甲基转移酶，可能参与PaP1基因组腺嘌呤的甲基化修饰过程。为证实ORF48的功能，本项目拟深入剖析PaP1的甲基化组，鉴定ORF48的m6A甲基转移酶功能及酶学特征，分析其特异的识别基序，并通过构建基序质粒、基因敲除与回补、单分子再测序等研究揭示ORF48介导PaP1腺嘌呤甲基化的分子机制，为噬菌体的表观遗传调控研究提供依据，并为探讨噬菌体拮抗宿主菌防御机制研究奠定基础。

DNA甲基化修饰是生物体表观遗传学的重要基础之一，在基因表达调控、生物拮抗中发挥重要作用。目前，对噬菌体及其宿主菌甲基化修饰及二者相互关系研究甚少。. 课题组分离鉴定了一株铜绿假单胞菌裂解性噬菌体PaP1，单分子实时（SMRT）测序证实其基因组中含6-甲基腺嘌呤（m6A）修饰，进一步分析发现噬菌体编码的ORF48是一推定的m6A甲基转移酶。然而，通过重组表达ORF48蛋白和凝胶阻滞实验（EMSA），表明ORF48可能并非一种6mA甲基转移酶，推测PaP1基因组的甲基化修饰可能借由其宿主菌介导。. 因此，本项目研究工作转向解析铜绿假单胞菌PA1的甲基化组及其与噬菌体PaP1甲基化之间的关系。通过使用SMRT测序技术对PA1的基因组进行了重测序，修正了之前二代测序的错误，且对PA1进行了比较基因组及泛基因组分析；使用生物信息学方法对PA1基因组的注释、毒力因子、调控蛋白、分泌系统、II型毒素-抗毒素系统及基因组岛进行了预测及分析。. 我们进一步绘制了PA1的全基因组单个碱基精度甲基化图谱，再结合生物信息学分析，预测出PA1所编码的一套I型限制-修饰系统的甲基转移酶（HsdM）及其对应的修饰基序。通过使用质粒克隆实验和SMRT重测序技术，证实了HsdM的活性和特异性。转录组比较分析发现与野生型PA1相比，I型R-M系统缺失突变体（PA1ΔhsdMSR）有270个差异表达基因（DEGs），其中95个基因表达上调，175个基因表达下调。DEGs显著富集于与核糖体、柠檬酸循环及碳代谢相关途径；hsdMSR位点的缺失也导致PA1生物被膜形成能力的削弱。. 此外，在本项目资助下，还分离鉴定了铜绿假单胞菌的一株新噬菌体PaoP5，并对其进行了基因组学和蛋白组学分析，将其划归PAK_P1噬菌体属；将铜绿假单胞菌噬菌体作为生物识别物质，开发出一种新型的电化学发光（ECL）生物传感器，可实现对铜绿假单胞菌的无标记检测。. 相应研究结果从表观遗传学角度增强了我们对铜绿假单胞菌及其噬菌体的理解，并揭示了DNA甲基化在细菌生命活动中的重要作用；基于噬菌体所开发的生物传感器将在铜绿假单胞菌的检测上发挥重要作用。