自噬体-溶酶体融合过程的特异性调控机制研究

Autophagy is an evolutionary conserved metabolic process in eukaryotes. When autophagy is induced, the double membrane phagophore will be formed and elongated to engulf damaged organelles or protein aggregate then sealed to be autophagasome. In the late stage of autophagy, autophagasomes will fuse with endo-lysosomes and degrade the cargoes by hydrolases. During this process, membrane fusion mechanism is both involved in the formation of autophagasome and autophagasome-lysosome fusion steps. In our previous study, we found that ATG14 could regulate the formation of basic autophagic membrane fusion functional unit-SNAREs complex. However, the specific regulator and copartners of SNAREs is not defined clearly. In this study, we will focus on the role of HOPS complex in autophagic membrane fusion, and also to distinguish other regulatory factors by un-bias proteomics analysis. We believe the findings of this study would significantly benefit demonstrating the molecular mechanism of autophagy, and contribute to reconstitute the complete autophagic membrane fusion process in vitro. More importantly, the accurate biochemical model could help to develop specific chemicals to target autophagy pathway in disease therapy.

细胞自噬是广泛存在于真核细胞中的一种代谢途径，通过溶酶体清除细胞中受损的细胞器及蛋白，细胞自噬被激活后，将由双层膜结构的自噬体将蛋白底物包裹，随后与内吞-溶酶体融合并降解，释放氨基酸等产物回收利用。其中，膜融合机制参与了自噬初期的自噬体膜结构形成和自噬末期的溶酶体降解过程。前期研究发现自噬SNARE蛋白可形成具有融合活性的四聚体，并在ATG14调节下构成最基本的膜融合所需功能单元介导膜融合，但该系统并不完整，其中膜融合调节蛋白并未清楚定义。本研究中，我们将关注HOPS复合物对自噬膜融合机制的直接调控机制。另外，我们将使用客观的蛋白组学手段鉴定其他SNARE结合蛋白，并通过生化、细胞生物学，分子遗传学手段揭示这些蛋白在细胞自噬中的功能与作用。该研究成果对完善细胞自噬分子机制有重要意义，并为在体外系统利用生化重建方法模拟自噬性膜融合体系提供依据，从而筛选自噬为靶标的治疗药物。

本项目筛选出了自噬性SNARE蛋白STX17和HOPS complex的相互作用蛋白Rab39A。利用Rab39A敲除细胞，证明了其通过促进自噬体-溶酶体的融合过程上调细胞自噬通量。且Rab39A可通过促进HOPS complex组分与SNARE蛋白之间的结合，及SNARE蛋白复合物的组装促进自噬性膜融合。进一步的研究显示，Rab39A的活化对其与HOPS complex的结合和招募是必须的。随后，利用体外生化重构系统，通过人工蛋白脂质体构建和荧光能量共振反应及电镜观察，证明了Rab39A-HOPS complex-Rab2复合体促进了SNARE介导的自噬体-溶酶体膜桥连与融合过程。随后我们通过体外生化实验和细胞实验验证了C9orf72蛋白可催化Rab39A的活化。通过C9orf72敲除细胞，进一步证明C9orf72也可通过影响自噬-溶酶体膜融合过程调控细胞自噬。Rab39A作为C9orf72的底物，其GTP活化形式可拯救C9orf72敲除引起的自噬抑制表型。综上，本研究通过体内外生化实验和细胞生物学实验证明了C9orf72-Rab39A-HOPS complex功能轴对细胞自噬的调控机制，首次提供了直接证据证明HOPS complex在真核细胞中自噬膜融合过程的作用，并揭示了自噬体-溶酶体融合这种异质性细胞器融合过程中对细胞器识别的机制，即Rab39A与Rab2分别在溶酶体和自噬体膜上招募HOPS complex组分。另外，由于C9orf72基因与神经退行性疾病ALS/FTD密切相关，故本研究为ALS/FTD潜在的病理机制提供了新的思路，疾病中C9orf72蛋白水平异常对下游Rab39A-HOPS的功能产生影响，从而导致自噬失调和蛋白质聚集物累积，加速了神经细胞的死亡，为ALS/FTD提供了新的治疗策略开发思路。