与β淀粉样蛋白单体相互作用引起JNK-Tau磷酸化的未知蛋白及其介导的细胞信号传导通路研究

In our previous studies using transgenic animal model of Alzheimer’s disease, and gene knock-out mice, we found that soluble Aβ1-42 induces phosphorylation of tau at T181 through β2 receptor-JNK pathway, however β2 receptor gene knock-out did not completely abolish the effects of soluble Aβ1-42 on JNK and tau phosphorylation, indicating that an unknown protein(s) mediated the above effects. Aβ1-42 tends to aggregate. Soluble Aβ1-42 contains Aβ oligomers (AβO), Aβ dimer (AβD) and Aβ monomer (AβM). In preliminary experiments, we isolated AβO, AβD and AβM by fast flow protein chromatography (FPLC), and found that AβM has a strong effect on Tau phosphorylation at T181. In the study, we constructed and expressed Halo- and His-tagged AβM. The tagged and untagged AβM are isolated by FPLC. Then we pull down the proteins that can interact with AβM from lysates of human neuronal cells by tagged protein co-precipitation and untagged protein co-immunoprecipitation. The proteins that can interact with Aβ are identified by mass spectrometry. From the proteins identified above, the protein(s) that mediates AβM-induced JNK and Tau phosphorylation will be identified and its signaling pathway will be analyzed through cellular and biochemical experiments. Thus to understand the biological function of AβM and its interacting protein(s).

本人曾经报导了β2受体基因敲除仅部分阻断可溶性β淀粉样蛋白（Aβ1-42）引起的JNK及Tau T181磷酸化，提示有未知蛋白介导了Aβ1-42的作用。Aβ1-42易聚合，其溶液中含有Aβ多聚体（AβO）以及少量二聚体（AβD）和单体（AβM）。用快速蛋白质液相色谱（FPLC）低温分离上述三种Aβ后，发现AβM有很强的诱导Tau T181磷酸化的作用。本研究，首先构建表达Halo及His标签标记的AβM。然后，利用FPLC低温分离标签标记的或无标签的AβM，通过标签蛋白共沉淀实验及无标签蛋白免疫共沉淀实验将人神经细胞中与AβM相互作用的蛋白质共同沉淀下来。再通过质谱检测鉴别与AβM相互作用的蛋白质种类。在此基础上，通过细胞生物学实验分析其中哪种蛋白质介导了AβM引起的JNK及Tau蛋白磷酸化以及相关的细胞信号传导通路。从而了解AβM及其作用蛋白的生物学功能和意义。

为进一步了解β2AR在阿尔茨海默病（AD）中的病理生理学意义，我们首先利用生物信息学手段分析了家族性AD突变基因Presenilin 1与β淀粉样蛋白前体（APP）双转基因动物以及在该动物基础上敲除β2AR后大脑中基因差异表达情况，发现β2AR-KO主要影响AD动物脑内蛋白质的代谢和递呈，该过程还与氧化应激反应有关。其次，我们开展了分子机理研究。Aβ42易于聚合，可溶性Aβ42溶液中含有Aβ多聚体（Aβ-O）以及少量二聚体（Aβ-D）和单体（Aβ-M）。为观察Aβ-M的作用，我们将pcDNA3.1(+)-Aβ-Halo转染到细胞中。转染该载体12小时后，检测到细胞发生了凋亡。我们利用RT-PCR法检测了凋亡关键蛋白基因的表达水平，包括BAX、BID、Bcl-xL和Bcl-2。两个促凋亡基因BAX和BID的表达水平上调，而促生存基因Bcl-xL和Bcl-2的表达水平下调。为了了解Aβ-M的细胞功能，我们用AKTA蛋白质快速液相色谱低温分离得到不同聚合状态的Aβ，并用分离得到的Aβ-M处理细胞。实验发现，Aβ-M可以诱导SH-SY5Y细胞中Tau蛋白Ser-214磷酸化，并且还可以使JNK蛋白Thr-183/Tyr-185发生磷酸化，而Aβ-D、Aβ-O和Aβ-P对SH-SY5Y细胞中JNK的磷酸化没有受到影响。利用转染后的真核细胞表达的Aβ-Halo（只以单体形式存在），通过标签pull-down实验，以及酵母双杂交实验，我们鉴定出β2AR可以与Aβ-M相互作用。细胞生物学实验中，我们分析了Aβ-M诱导的细胞信号转导通路，发现Aβ-M通过β2AR-cAMP-PKA-JNK以及β2AR-GRK2-MEK-JNK信号通路诱导Tau蛋白发生磷酸化，而不是通过β2AR-Epac通路。因为胰岛素受体 (INSR)-mTOR-p70S6K信号通路的几个组成部分在AD大脑中异常，所以我们还进一步分析了Aβ诱导p70S6K磷酸化的作用，结果表明，Aβ-M在诱导p70S6K激酶Thr-389磷酸化，而Aβ-D、Aβ-O和Aβ-P几乎没有作用。除了以上研究内容，我们还利用真核细胞中表达的Aβ，通过标签pull-down实验分离得到与Aβ相互作用的细胞膜蛋白质，并且通过质谱法分析确定与Aβ相互作用的蛋白质的种类，从而更进一步了解了Aβ-M和β2AR在AD中所发挥的病理生理学作用。