调控Keap1与Nrf2相互作用的Keap1蛋白未知磷酸化位点及磷酸化信号传导通路研究

The regulation of Keap1 on intracellular level of Nrf2 is the most important mechanism regulating redox homeostasis in a living organism. Nrf2， which is a transcription factor, regulates the expression of more than 100 genes by binding to antioxidant response element (ARE); it is rapidly degradated in a ubiquitin-dependent manner after binding to its endogenous inhibitor Keap1.The separation of Keap1 from Nrf2 is not sensitive to oxidative stress, and intracellular phosphorylation-signaling system may involved in regulating the separation, however, the signal regulating process has not been elucidated yet. It is hypothesized in the proposal that there are special amino residues that can be phosphorylated to regulate the binding of Keap1 to Nrf2, which in turn influence the signal transduction from Nrf2 to ARE. In the proposal, direct approaches involving molecular biological, mass spectrometric and biochemical methods will be employed to identify the phosphorylation sites on Keap1 and its upstream signaling pathways. The study will benefit basic and new medicine-related studies on antioxidation,anti-inflammation, tissue regeneration, growth and development, prevention of carcinogenesis, anti-aging, and prevention of Alzheimer's diseases.

Keap1蛋白对细胞内Nrf2蛋白水平的调节是生物体内调节氧化还原稳态水平的主要方式。转录因子Nrf2通过与抗氧化反应元件（ARE）结合，诱导100多种基因的表达；Nrf2与其胞内抑制物Keap1结合后迅即发生泛素依赖性降解。现有研究表明，Keap1与Nrf2的分离过程对氧化应激不敏感，可能需要细胞内的蛋白质磷酸化信号系统参与调控Keap1与Nrf2的相互作用，但目前尚未发现细胞内磷酸化信号系统调节Keap1与Nrf2相互作用的方式。本项目假设，Keap1蛋白上的特定氨基酸位点磷酸化可以调节Keap1与Nrf2的相互结合，从而影响Nrf2-ARE信号传导。本项目采用分子生物学、质谱分析和生物化学等直接的实验方法研究分析具有上述调节功能的人Keap1磷酸化位点及主要信号传导通路，为抗氧化、抗炎、组织再生、生长发育、预防肿瘤、抗衰老、以及老年痴呆等基础和应用研究提供确切的依据。

Nrf2是细胞应激反应中的重要转录因子，能诱导抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表达。越来越多的研究发现了Nrf2在人体衰老过程以及保护我们的身体免受药物毒性和压力诱发的疾病中所起的作用。Keap1- Nrf2-ARE（Antioxidant response element）信号通路的分子基础的研究对预防疾病的发生、治疗疾病以及解决耐药性至关重要。已有研究指出，Keap1的一些修饰影响Keap1与Nrf2的相互作用，从而影响ARE介导的基因表达。Keap1的Cys残基可能作为氧化和亲电压力的传感器影响Nrf2和Keap1的相互作用。目前尚无Keap1磷酸化位点的确切报道，并且Keap1蛋白磷酸化对Keap1与Nrf2的相互作用尚不明确。我们利用人源细胞，研究在氧化应激时Keap1有哪些位点发生修饰，以及模拟磷酸化修饰对Keap1与Nrf2的相互作用的影响。.首先构建真核表达载体转染HEK293细胞，表达Halo-Keap1融合蛋白。用400 μM H2O2刺激后，从细胞中纯化Keap1蛋白。利用质谱法鉴定Keap1蛋白的磷酸化位点。针对质谱法鉴定出的Keap1蛋白磷酸化位点之后，利用点突变技术表达模拟磷酸化Keap1蛋白，通过多种实验研究其对Keap1和Nrf2的相互作用以及Nrf2细胞核迁移的影响，包括Halo标签Pulldown实验、酵母双杂实验、凝胶电泳迁移实验、qRT-PCR实验、蛋白质结构建模等。.质谱分析显示S53和S293氨基酸残基在氧化应激条件下发生磷酸化。Ser53位点保守性较高，S53突变为谷氨酸（E）模拟磷酸化带负电荷，抑制Keap1与Nrf2相互作用，促进Nrf2入核，诱导抗氧化基因表达。蛋白结构建模及动力学模拟显示，S53突变为E53后，可与第50位精氨酸残基形成离子键，Keap1蛋白氨基末端构象发生变化。该研究发现了Keap1蛋白新的潜在磷酸化位点，可以调节Keap1-Nrf2信号通路依赖性抗氧化基因的表达。该项目为深入研究Keap1-Nrf2- ARE信号通路相关研究奠定基础，为研发新的针对Keap1-Nrf2这一重要抗氧化通路的抗衰老药物提供细胞生物学依据。