Pseudomonas putida KT2440菌株芳烃代谢中间产物粘糠酸内酯的转运机理研究

通常微生物降解芳烃的前提是底物特异性的转运蛋白将芳烃转运至降解菌细胞内部。芳烃降解模式菌Pseudomonas putida KT2440全基因组已测序，通过邻位开环途径降解芳烃时，cat基因簇编码邻苯二酚的Beta-酮己二酸代谢途径的相关酶，粘糠酸内酯是芳烃中间产物之一，但其转运机制尚无报道。cat基因簇附近无转运蛋白基因，推测其可能位于其他基因簇中。分析该菌全基因组，mulH1和mulH2可能是粘糠酸内酯转运蛋白基因。拟通过分子生物学、生物化学、高效液相色谱分析和紫外共聚焦显微术等，鉴定两个可能的粘糠酸内酯转运蛋白的功能，分析其表达水平的差异，证明其有转运蛋白共同的膜蛋白特征。该研究将首次证明：KT2440菌具备两个有差异、有功能、AAHS家族的、新型芳香酸转运蛋白- - 粘糠酸内酯转运蛋白。从分子生物学水平揭示粘糠酸内酯转运机制及其对代谢途径的影响，使该代谢途径的研究更加完整而有意义。

通常微生物降解芳烃的前提是底物特异性的转运蛋白将芳烃转运至降解菌细胞内部。Escherichia coli K-12 W3110全基因组已测序，其可以利用3-羟基苯丙酸为唯一的碳源和能源生长。Escherichia coli K-12代谢3-羟基苯丙酸的相关基因已得到了功能鉴定，其中位于代谢基因簇中的mhpT却仅推测与3-羟基苯丙酸转运吸收相关，但其功能及3-羟基苯丙酸转运机理尚未进行研究证明。本研究通过生物信息学分析，推测MhpT可能是一种属于AAHS家族膜蛋白3-羟基苯丙酸转运蛋白。共聚焦显微术观察MhpT-GFP融合蛋白位于细胞膜上。14C标记的化合物的转运研究这么MhpT专一性的转运3-羟基苯丙酸（Vmax = 650 ± 0.57 nmol/min/mg protein, Km =23.17 ± 0.16 M），并且该主动运输是依赖于能量的。在pH 6.2，pH 7.2 和pH 8.2条件下，mhpT敲除互补菌株的转运实验和生长实验均证明了pH 8.2情况下，主动运输是生存所必须的。定点突变实验证明了，Glu-27，Asp-75，Ala-272和Lys-276对转运活力有明显的影响。酶学检测证明了，MhpT的存在与否对后续代谢的第一步酶活力有显著影响。利用融合蛋白技术在共聚焦显微镜下观察，同样证明了Pseudomonas putida KT2440中潜在的3-羟基苯丙酸转运蛋白HppT和潜在的粘糠酸内酯转运蛋白MulH1和MulH2均为膜蛋白。该研究从分子生物学水平揭示了MhpT介导的3-羟基苯丙酸的转运机制及其对代谢途径的影响及其对代谢途径的影响，使该代谢途径的研究更加完整而有意义，丰富了微生物代谢芳香酸的理论基础。