靶向miR-21增强人结肠癌细胞化放疗敏感性的研究及其机制的初步探讨

miRNA可能参与肿瘤细胞耐药。前期研究发现miR-21在结肠癌组织及部分结肠癌细胞系表达明显上调，5-FU耐药结肠癌细胞系HT-29/5-FU miR-21表达明显上调，提示miR-21与结肠癌发生、发展及耐药密切相关。本研究在此基础上构建慢病毒载体携带反义miR-21及Pre-miR-21，在体外观察miR-21过表达和沉默对细胞生长、细胞周期、细胞凋亡、克隆形成及细胞侵袭力的影响及对5-FU及放射线敏感性的变化；在体内观察miR-21过表达及沉默对移植瘤生长的影响及与5-FU及放射线联合对肿瘤的生长抑制的作用；并运用生物信息学预测miR-21的靶基因,结合基因芯片进一步确定5-FU耐药相关靶基因,通过荧光酶报告系统验证预测的靶基因；还探讨miR-21对5-FU代谢相关酶及hMSH2表达的调控。该项目从miRNA水平来阐明肿瘤耐药的发生机制,为逆转肿瘤耐药提供了崭新的思路。

miRNAs可能参与肿瘤细胞耐药。我们的前期研究发现miR-21在结肠癌组织及部分结肠癌细胞系中表达上调，5-FU耐药结肠癌细胞系HT-29/5-FU中miR-21的表达明显上调，提示miR-21与结肠癌发生、发展及耐药密切相关。基于此研究基础，构建慢病毒载体携带反义miR-21及Pre-miR-21，通过体内外观察miR-21过表达和沉默对细胞生物学行为的影响及对化、放疗敏感性的变化；运用生物信息学预测miR-21的靶基因，结合基因芯片进一步确定与5-FU耐药相关靶基因；探讨miR-21对5-FU代谢相关酶及hMSH2表达的调控。我们的体外实验结果发现miR-21过表达能够抑制人结肠癌HT-29细胞凋亡、促进增殖、细胞克隆形成能力及侵袭性增强，肿瘤细胞对5-FU及放射线抵抗力增强；miR-21沉默能够抑制人结肠癌细胞增殖、促进凋亡，抑制克隆形成及侵袭性，逆转肿瘤细胞对5-FU耐药及放射线耐受。荧光素酶报告基因实验证实hMSH2是miR-21的靶点；此外，miR-21还可通过间接调控5-FU代谢酶（TP和DPD）参与结肠癌对5-FU耐药。体内实验显示miR-21过表达可促进裸鼠移植瘤的生长，降低移植瘤对放化疗的敏感性；沉默miR-21的表达能抑制裸鼠移植瘤的生长，增加移植瘤对放化疗的敏感性。此外，我们采用5-FU持续接触浓度递增的方法成功建立了在1 μg/ml 5-FU浓度下稳定生长的人结肠癌耐药细胞株HT-29/5-FU，耐药指数为3.59。与HT-29细胞相比，HT-29/5-FU细胞形态发生改变，生长缓慢，克隆形成率降低，TS和DPD高表达，S期细胞比例增多，更能耐受5-FU诱导的细胞凋亡。通过基因芯片技术本课题组还筛选出耐药细胞株和亲本细胞株中差异表达的基因，为后续肿瘤耐药标记物的研究筛选提供前期基础和实验依据。本研究提示miR-21可成为结肠癌治疗的潜在靶点，为逆转肿瘤耐药提供了新思路。