E3泛素连接酶FBXW5失活Hippo通路促胃癌细胞转移的分子机制

Metastasis is one of the important causes of death of gastric cancer patients. Hippo-YAP pathway plays crucial roles in gastric cancer cell metastasis, but the mechanism underlying inactivation of this pathway remains unclear. In our preliminary work, analysis of immunohistochemistry on gastric cancer tissues revealed significant overexpression of FBXW5 was associated with TNM staging and lymph node metastasis, and the high cytoplasm expression of FBXW5 predicted a poor overall surviral time of patients. We found FBXW5 interacted with LATS1/2 protein, but not YAP protein in gastric cancer cell. Knockdown of endogenous FBXW5 inhibited cell proliferation and invasion. Moreover, FBXW5 downregulation increased expression of LATS1/2 in BGC-823 and HGC-27 cells, then suppressing YAP and its target genes expression. So, we hypothesized that FBXW5 could promote LATS1/2 degradation via ubiquitination, then facilating gastric cancer cell metastasis. Therefore, in the present project, we aim to use co-immunoprecipitation (Co-IP), chromatin immunoprecipitation (Chip), GST pull-down assay and microarray to illuminate how FBXW5 inactive the Hippo-YAP pathway. Using both in vitro and in vivo systems, and clinical samples to further investigate the mechanism by which FBXW5 promotes the metastasis ability of cancer cells and how Hippo-YAP pathway is inactivated in gastric cancer. Those results may provide new biomarkers and therapeutic targets for the diagnosis and treatment of gastric cancer.

胃癌转移是导致患者死亡的重要原因，研究表明Hippo-YAP通路在胃癌转移过程中发挥重要作用，然而其失活的机制尚不清楚。我们前期研究发现：（1）E3泛素连接酶FBXW5在胃癌组织和细胞系中高表达，其高表达预示患者易转移和预后不良；（2）FBXW5能与LATS1/2激酶结合，而不能结合YAP蛋白；（3）下调FBXW5表达显著抑制胃癌细胞增殖和侵袭，并通过激活LATS1/2表达抑制YAP及其相关靶基因转录；据此，我们推测FBXW5通过泛素化降解LATS1/2蛋白，从而失活Hippo-YAP通路，促胃癌细胞转移。本项目将以抑制或高表达FBXW5的细胞为模型，通过免疫共沉淀、GST pull-down及基因芯片等方法，探讨FBXW5失活Hippo-YAP通路的分子机制。通过采用裸鼠动物模型和胃癌组织样本，系统阐明FBXW5促胃癌转移的作用和临床意义，为胃癌的早期诊断和靶向治疗提供新的方法和思路。

背景：.Hippo通路异常导致胃癌发生和进展。其核心成分LATS1/2激酶结构域PPxY序基与WD40结构域结合并被泛素化、降解。F-box蛋白家族是SCF（Skp1-Cullin1-F-box protein）E3连接酶复合物中的一员，FBXW5作为F-box蛋白家族成员，含有重复的WD40片段，然而其在胃癌中的作用还不清楚。本研究旨在探讨FBXW5与Hippo通路的关系及其在胃癌中的意义。.方法及内容：.利用生物信息学分析工具分析FBXW5的表达及其预后意义、分析FBXW5与Hippo通路下游相关基因表达的关系；利用免疫组化法分析石蜡样本中蛋白的表达以及裸鼠皮下瘤体中各蛋白的表达；Western blot分析新鲜临床标本及裸鼠瘤体中FBXW5的表达，及各样本或细胞中FBXW5蛋白与Hippo通路相关蛋白的调控关系；利用qPCR探讨FBXW5对Hippo通路相关癌基因的调控；免疫荧光法探讨YAP1的细胞内定位；Transwell小室试验、细胞划痕试验探讨FBXW5对胃癌细胞侵袭迁移能力的影响；CCK-8及平板克隆形成实验研究FBXW5对细胞耐药的影响；免疫共沉淀分析FBXW5与Hippo通路各核心成分的结合关系；CHX半衰期试验分析FBXW5对LATS1半衰期的影响；体内泛素化试验验证FBXW5对LATS1泛素化过程的促进作用；裸鼠皮下成瘤实验验证FBXW5对移植瘤生长速率的影响。.实验结果：.生物信息学分析显示FBXW5 mRNA和蛋白在多种恶性肿瘤中表达。Western blot实验证明FBXW5蛋白在胃癌中高表达。通过免疫组化及随访信息分析FBXW5的临床意义，发现FBXW5高表达患者预后差（发现组：log-rank p = 0.020；验证组：log-rank p = 0.025）。细胞功能学实验证实干扰FBXW5抑制胃癌细胞的侵袭、转移及EMT；上调FBXW5则相反。且FBXW5诱导胃癌细胞对5-氟尿嘧啶和顺铂的抵抗。通过对TCGA和GTEx数据库的挖掘和分析提示FBXW5调控Hippo通路下游的靶基因，随后用荧光定量PCR对这一结果进行了验证。Western blot和免疫荧光实验结果提示FBXW5对Hippo信号通路存在调控作用，FBXW5促进YAP1蛋白的入核；免疫共沉淀法和体内泛素化实验提示FBXW5与LATS1蛋白存在结合，缩短LATS1蛋白的