卵母细胞微流体低温保存过程的理论与实验研究

In order to minimize osmotic and toxic damage to oocytes during cryopreservation, theoretical and experimental research on oocyte cryopreservation in microfluidic device were carried out in this study. First, mixed flow process in the microfluidic channel was simulated numerically, the concentration field, velocity field and temperature field distribution in the microfluidic channel were obtained. The flow and permeability behavior of oocyte in microfluidic channel were studied, oocyte volumetric responses and cryoprotectant（CPA） concentration inside oocyte were calculated by three-parameter model. The implementation effect of linear profile, index profile and logarithmic profile were theoretically modeled, thus the optimal CPA loading/remove protocol was determined. Then, the microfluidic chip was fabricated in PDMS, soft lithography was employed. The chip incorporates channel mixer, cell operation chamber, oocyte loading/unloading channel and its pneumatic valve and temperature control module. Finally, the CPA diffusion behavior along the channel was tested, oocyte osmotic and toxic damage coupling experiment, CPA toxicity change with temperature and oocyte cryopreservation experiment, were conducted on this microfluidic device. The project has important significance to improve the clinical application of oocyte cryopreservation.

为了减小卵母细胞低温保存的渗透损伤和毒性损伤，本项目拟开展卵母细胞微流体低温保存过程的理论与实验研究。首先，对微流体混合流动过程进行数值模拟，得出混合通道内浓度场、速度场、温度场的分布及其影响因素；对卵母细胞在微流体内的流动及渗透行为进行数值模拟，采用三参数模型计算卵母细胞体积及细胞内保护剂浓度变化；对线性变化、指数变化、对数变化保护剂添加/去除方案的实施效果进行理论模拟，确定优化的保护剂浓度改变方案。然后，以聚二甲基硅氧烷（PDMS）为材料，利用软刻蚀技术制作微流体芯片，包括溶液混合通道、卵母细胞操作腔、细胞进出通道及微阀控制模块、温度控制模块几部分。最后，对溶液混合通道中的流动混合效果进行测试，并在该装置上开展卵母细胞渗透损伤与毒性损伤的耦合实验、保护剂对卵母细胞的毒性随温度变化的实验以及卵母细胞低温保存实验。本项目的开展对于提高卵母细胞低温保存在临床应用上的成功率有重要意义。

为了减小卵母细胞低温保存的渗透损伤和毒性损伤，本项目开展了卵母细胞微流体低温保存过程的理论与实验研究，各项研究内容基本按照项目计划进行。具体情况如下：（1）对微流体混合流动过程进行了理论模拟，得出了混合通道内浓度场、速度场分布以及压力降情况，分析了流体流速以及微通道结构对混合的影响；（2）对卵母细胞在微流控装置中的渗透行为进行了模拟，比较了不同加载方法下，卵母细胞体积及细胞内保护剂浓度随时间的变化，通过细胞归一化体积V、积累型渗透损伤AOD和积累型毒性损伤J及基于熵值法的综合损伤S，评估了不同加载方法对细胞的渗透损伤和毒性损伤；（3）逐步分析加载-去除过程的每一步对细胞存活率的影响，确定了卵母细胞的渗透损伤主要发生在卵母细胞从冷冻液转移至解冻液以及保护剂去除阶段，保护剂添加过程与洗脱过程有很强的相关性；（4）制作了适合卵母细胞冷冻保护剂加载/去除的微流体装置，优化了线性法加载/去除总时间、加载/去除液成分及浓度，结果表明微流控线性法能够减轻卵母细胞的渗透损伤，处理后卵母细胞的存活率显著高于分步法加载/去除法；（5）组合微注射泵的注射模式，设计了保护剂的凸型、线性、凹型添加和凸型、线性、凹型变化，组合出9种添加-去除联用方案，结果表明保护剂凹型添加-凸型去除时，得到的存活率及桑椹胚率与新鲜组差异最小；（6）微流控法添加-去除保护剂与冷冻载体Cryotop搭配使用冷冻卵母细胞，冻后卵母细胞存活率以及卵裂率都显著高于传统冷冻组，降低了卵母细胞的早期凋亡率和胞内活性氧水平，减小了线粒体损伤；（7）采用传热性能较好的透明陶瓷材料制作一体化芯片，进行卵母细胞冷冻实验，与传统OPS冷冻的保存结果无显著差异，还有进一步提升的潜力。.微流体装置能够显著减少卵母细胞冷冻保护剂添加与去除过程的渗透损伤，本项目首次成功制作了一体化微流控芯片用于卵母细胞的低温保存，打破了传统的技术思路，在辅助生殖领域有较好的临床应用前景。